不同妊娠期HPV感染孕妇血清miRNA-34a表达情况及与母婴结局的关系

罗婕妤 (湛江市第二人民医院妇产科，广东 湛江 524003)

人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)是一种球形DNA病毒，隶属于乳多空病毒科-乳头瘤空泡病毒A属，可穿透人体表皮及黏膜上皮细胞，引发各类良恶性病变，以寻常疣、生殖器疣、鼻咽癌、子宫颈癌前病变及宫颈癌等多见[1]。此外，妊娠期HPV感染也较为多见，可使孕妇本身、胎儿及新生儿产生不良结局，引起学者们关注[2]。宫颈分泌物基因芯片HPV DNA分型检测是目前孕妇HPV筛查的主要方式，是一种侵入性检查方式，部分孕妇对此持怀疑态度，不愿意进行该项检查，造成漏诊，威胁母婴健康[3]。因此，寻找一种安全、有效的检测方法及指标显得十分重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种长约22 nt的非编码RNA，广泛分布于从病毒到人类的各种生物中，主要通过与信使RNA(mRNA)结合发挥作用从而参与疾病的发生发展，可在人血清中丰富、稳定表达，大部分研究提示血清miRNA检测是目前临床(包括良恶性疾病及孕期检测等)新起的一种无创检查方式，前景可观[4]。有研究显示miRNA-34a在HPV持续感染型宫颈癌中异常表达，提示miRNA-34a可能与HPV感染相关[5]。但关于其与HPV感染孕妇的报道较为少见。本研究对HPV阴性和HPV阳性不同妊娠期孕妇血清miRNA-34a表达进行探讨。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取2016年3月～2018年3月于本院产检进行HPV筛查的320例孕妇作为研究对象，根据HPV检测结果不同将其分为HPV阳性组(n=120)和HPV阴性组(n=200)。纳入标准：①B超显示活胎，单个妊娠；②均行宫颈分泌物基因芯片HPV DNA分型检测者；③临床资料完整且依从性良好者。排除标准：①患妊娠期合并症或并发症者；②合并宫颈上皮内瘤变疾病或宫颈癌者；③有不良妊娠结局或新生儿结局者；④人工受孕者；⑤有精神病病史或家族史者。HPV阳性组：平均年龄(31.34±5.62)岁；产妇类型：初产妇74例，经产妇46例；妊娠期：早期49例，中期52期，晚期19例；HPV阴性组：平均年龄(30.94±5.49)岁；产妇类型：初产妇120例，经产妇80例；妊娠期：早期78例，中期84期，晚期38例；两组在年龄、产妇类型及妊娠期等临床资料上比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。同时选取年龄匹配的50例健康非孕女性作为健康对照组。所有研究对象均签署知情同意书，本次研究经过本院医学伦理委员会批准同意。

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1.2方法

1.2.1HPV检测[6]：①标本收集：嘱孕妇平躺取截石位，以窥阴器暴露宫颈，用无菌棉签擦去宫颈口分泌物，用HPV专用刷在宫颈管内顺时轻柔旋转5圈并停留1min进行取样，后将置入专用管中保存及运送；②基因芯片HPV DNA分型检测：本研究用广东凯普生物科技股份有限公司HPV分型检测试剂盒对分泌物进行DNA提取、扩增及导流杂交，最后获得检测结果，共有21种基因型，清晰可见的蓝紫色图点被认为阳性，根据条膜HPV分布图判断HPV感染基因型。

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1.2.2血清miRNA-34a检测[7]：①标本收集：采集5 ml空腹静脉血于黄色血清管中，轻柔混匀，4 000 r/min离心5 min，留取血清于EP管，并于-80℃冰箱中保存待检测；②血清miRNA-34a检测：本研究分别用北京天根生化科技公司总RNA提取试剂盒和美国Thermo Fisher Scientific公司逆转录试剂盒+实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)试剂盒对血清标本进行RNA提取、cDNA合成及FQ-PCR检测，以2-ΔΔCt法表示miRNA-34a相对表达水平。

2 结果

2.5HPV阳性组新生儿不良结局与血清miRNA-34a的关系:HPV阳性组新生儿均出生，其中早产者和呼吸窘迫综合征者分别为6例和8例，其血清miRNA-34a分别为4.92±0.83和5.13±0.98；非早产者和非呼吸窘迫综合征者分别为114例和112例，其血清miRNA-34a分别为4.02±0.27和3.75±0.62；早产者和呼吸窘迫综合征者血清miRNA-34a分别高于非早产者和非呼吸窘迫综合征者，且差异有统计学意义(t=6.829、P=0.000；t=5.829、P=0.000)。

那阵子，在我按市专家的处方每天上、下午到小区的西医诊所各点一组头孢后，我的症状明显减轻了。其中最显著的例子就是晚上能睡个安稳觉了。虽说睡梦中还是难免不时地咳上几声，但绝不会咳醒。这还是老婆告诉我的。正因如此，市专家嘱我半月后回市医院复诊，我都没去，而是听从了小区西医诊所中那位小护士的建议，停止滴流后继续口服头孢及化痰药。

图1 不同组别血清miRNA-34a比较

2.4影响HPV感染孕妇妊娠不良结局的多因素Logistic回归分析：经多因素Logistic回归分析得知，HPV高危型、HPV高危型种数及血清miRNA-34a是导致HPV感染孕妇妊娠不良结局发生的关键因素(P=0.014；P=0.001；P=0.000)。见表1。

图2 HPV阳性组不同妊娠期孕妇血清miRNA-34a比较

2.3HPV阳性组孕妇妊娠结局与血清miRNA-34a的关系：HPV阳性组中剖宫产者30例、产后出血者9例、胎膜早破者8例和产褥感染者4例，其血清miRNA-34a分别为5.37±0.91、5.17±0.69、5.07±1.31和5.35±0.67；顺产者90例、产后未出血者111例、无胎膜早破者112例和无产褥感染者116例，其血清miRNA-34a分别为3.85±0.57、4.02±0.72、4.12±0.34和3.88±0.55；剖宫产者、产后出血者、胎膜早破者和产褥感染者血清miRNA-34a分别高于顺产者、产后未出血者、无胎膜早破者和无产褥感染者，且差异有统计学意义(t=9.349、P=0.000；t=4.621、P=0.000；t=5.657、P=0.000；t=5.224、P=0.000)。

1.3随访：对320例孕妇进行随访直至其分娩后1个月，记录孕妇分娩方式、产后并发症及新生儿不良结局发生情况。所有孕妇均在访，无失访。

2.2HPV阳性组不同妊娠期孕妇血清miRNA-34a比较：HPV阳性组中早期妊娠、中期妊娠和晚期妊娠孕妇血清miRNA-34a分别为4.61±0.75、4.59±0.72和4.73±0.65，三者比较差异无统计学意义(F=0.246,P=0.782)。见图2。

表1 影响HPV感染孕妇妊娠不良结局的多因素Logistic回归分析

2.1不同组别血清miRNA-34a比较：HPV阳性组、HPV阴性组和健康对照组血清miRNA-34a分别为4.58±0.74、1.09±0.44和0.98±0.26，三组比较差异有统计学意义(F=1744.049,P=0.000)。见图1。

2.6影响HPV感染孕妇新生儿结局的多因素Logistic回归分析：经多因素Logistic回归分析得知，HPV高危型种数和血清miRNA-34a是导致HPV感染新生儿不良结局发生的关键因素(P=0.000；P=0.027)。见表2。

表2 影响HPV感染孕妇新生儿结局的多因素Logistic回归分析

3 讨论

与其他女性相比，妊娠期女性更容易被HPV感染，这是因为孕妇雌孕激素明显升高，其他内分泌激素也随之改变，机体免疫力有所下降，皮肤及黏膜固有免疫和细胞免疫均被破坏，HPV侵袭入机体[8]。此外，有研究发现机体雌孕激素、人绒毛膜促性腺激素、催乳素及肾上腺素等免疫抑制激素上升，HPV感染妊娠期女性后宫颈相关病变进程加快，因此明确是否存在妊娠期HPV感染对孕妇产后预后十分重要[9]。宫颈分泌物基因芯片HPV DNA分型检测是目前诊断HPV感染的主要方法，受标本本身、运送及保存等多种因素影响敏感性和特异性并非十分理想，因此寻找有效血液学指标进行联合检测迫在眉睫[10]。与mRNA比较，miRNA更为稳定，既可耐受长期保存和反复冻融等物理因素，又可耐受核糖核酸酶等生物因素，为其成为临床疾病检测的重要指标提供理论依据[11]。miRNA-34家族在哺乳动物中广泛存在，包括miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c三个成员，均有高度保守性[12]。目前关于miRNA-34a研究较多且多与肿瘤相关，有学者发现miRNA-34a在诊断乳腺癌中敏感性和特异性均较高，且从细胞水平肯定了其在乳腺癌中的治疗前景[13]。陈贝贝等则在通过对60例HPV感染者宫颈脱落细胞研究发现miRNA-34a与HPV持续感染密切相关[5]，肯定了其作为HPV持续感染在宫颈癌早期筛查和临床诊疗的探讨价值。

贵州省平塘县水稻田75%以上常年发生水稻稻纵卷叶螟和稻飞虱，发生程度在3级以上，危害重的年份稻纵卷叶螟、稻飞虱和福寿螺发生程度达5级。如2008年稻飞虱、稻纵卷叶螟均为5级发生，福寿螺为3级发生；2009年水稻白背飞虱为5级发生、稻纵卷叶螟第3代为5级发生，第4代为3级发生，福寿螺为5级发生；2010年水稻白背飞虱为4级发生、稻纵卷叶螟第3代为4级发生，第4代为3级发生，福寿螺为4级发生；2011年稻飞虱为4级发生、稻纵卷叶螟为3级发生。害虫的严重发生导致全县水稻年损失量在300万公斤以上，大发生年份全县水稻减产达20%～30%。

本研究中，选取120例HPV感染孕妇和200例无HPV感染孕妇作为研究对象，探讨 miRNA-34a在孕妇HPV感染中的诊断价值，发现HPV阳性组血清miRNA-34a明显高于HPV阴性组，提示血清miRNA-34a在孕妇HPV感染鉴别诊断中的临床价值，此外，本研究还选取50例健康非孕女性作为对照以排除女性因受孕导致血清miRNA-34a干扰。本研究还发现HPV阳性组中早期妊娠、中期妊娠和晚期妊娠三者孕妇血清miRNA-34a比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示血清miRNA-34a与HPV感染孕妇妊娠期无明显相关，可能与样本量及分布情况相关，可后续扩大样本量、优化分布情况继续探讨。此外，本研究还发现HPV感染孕妇发生妊娠不良结局者和新生儿不良结局者血清miRNA-34a均明显高于无上述情况发生者，提示血清miRNA-34a在HPV感染孕妇妊娠结局和新生儿结局预测中的临床价值。最后，本研究经多因素Logistic回归分析发现HPV高危型种数和血清miRNA-34a是导致HPV感染孕妇母婴不良结局的关键因素，再次肯定血清miRNA-34a在HPV感染孕妇诊断及预后估测中的价值，并提示临床工作者应明确HPV感染孕妇HPV分型情况，对HPV高危型者多予关注，警惕不良结局发生或在不良结局发生时及时处理，减少伤害。

综上所述，血清miRNA-34a在HPV感染孕妇中明显升高，与妊娠期无明显关系，是导致妊娠不良结局和新生儿不良结局发生的关键因素，有一定临床指导价值。