基于TCGA数据库的胃癌预后miRNAs筛选及预后评估模型构建

代孟祝 (四川大学华西广安医院消化内科，四川 广安 638500)

胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤。我国是胃癌高发国家，据统计2015年我国胃癌发病人数仅次于肺癌，同时胃癌相关死亡人数在所有恶性肿瘤中高居第三位，且胃癌的发病率仍呈现上升趋势[1]。近年来，随着诊断和治疗技术的发展，我国胃癌早期发现率显著提高，预后有明显改善，且晚期胃癌的预后仍较差，5年生存率不到10%[2-4]。小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为18～25碱基的短链非编码RNA，尽管miRNA不编码蛋白，但成熟的miRNA可以与mRNA的3′UTR区结合，在转录后水平抑制靶基因的表达，研究表明miRNA表达异常与癌症发生发展相关[5]，因此miRNA具有潜在的诊断和预测价值。基于miRNA表达谱的系统性标志物筛选对胃癌发病机理、治疗靶点开发和预后评估具有重要意义。目前关于胃癌预后miRNA的系统性研究较少，本研究基于癌症基因图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中公开的胃癌miRNA表达数据，提取临床信息，利用Cox回归分析筛选胃癌预后相关miRNAs，并构建预后风险评分模型，同时对预后miRNA进行功能分析，揭示miRNA在胃癌中的调控作用和预后风险评估中的应用价值。

1 资料与方法

1.1数据下载与处理：利用R(version 4.0.0)中RTCGA包下载TCGA数据库中胃腺癌(Stomach adenocarcinoma，STAD)的miRNA数据，提取RNA表达矩阵和患者临床资料，该数据包括41例正常组织样本和436例胃癌样本。对提取的表达矩阵依次过滤0值和低表达miRNA，去除正常组织样本和临床信息不完整的胃癌样本，最后对表达数据进行标准化和Log2转换，获得389个胃癌样本的618个miRNA表达矩阵用于后续分析。本研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2Cox回归分析构建STAD预后风险模型：利用R中的Survival包对618个miRNA依次进行单变量Cox回归分析，根据P<0.05筛选与预后相关的miRNA。利用R中的Survival包对预后相关的miRNA进行Cox 多变量回归分析，构建比例风险模型，计算风险评分(Risk Score)，根据风险评分中位数将患者划分为高风险组和低风险组，并绘制生存曲线(Kaplan-Meier法，KM曲线)和受试者工作特征(ROC)曲线，评估模型预测效果。

1.3miRNA靶基因功能分析：利用在线预测工具miRWalk (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)对STAD预后相关的miRNA进行靶基因预测[6]，min P-value为>0.95，结合区域为3′ UTR，输出与TargetScan数据库共有的靶基因，利用R包对靶基因进行KEGG信号通路富集分析。

2 结果

2.1STAD预后miRNA筛选及风险评分模型：通过单变量Cox回归分析共筛选到33个STAD预后相关的miRNA(P<0.05)，将筛选到的33个miRNA进行多变量Cox回归分析确定最优模型，得到14-miRNA的STAD预后风险评估模型。根据β>0且HR>1表明hsa-mir-184、hsa-mir-7-1、hsa-mir-541、hsa-mir-597、hsa-mir-676和hsa-mir-3143等miRNA为胃癌预后风险因素，根据β<0且HR<1表明hsa-mir-3648、hsa-mir-7-2、hsa-mir-362、hsa-mir-3161、hsa-mir-3610和hsa-mir-320c-2等miRNA为STAD预后保护因素。见表1。

表1 Cox回归分析结果

根据构建风险评分模型，对所有患者计算Risk Score，根据Risk Score将患者分为高风险组和低风险组进行生存分析，绘制KM曲线见图1，结果显示高风险组与低风险组预后差异有统计学意义(P<0.01)；同时绘制ROC曲线见图2，结果显示AUC面积为0.793，提示模型具有较好的预测效果。

图1 基于14-miRNA风险评分的胃腺癌患者KM生存曲线

图2 14-miRNA预后预测模型ROC曲线

2.2胃癌预后相关miRNA靶基因功能分析：对14个胃癌预后miRNA利用miRWalk在线分析工具进行靶基因预测，预测靶基因共355个基因，对靶基因进行细胞信号通路富集分析，结果显示主要信号通路为：细胞衰老、胶质瘤、非小细胞肺癌、人巨细胞病毒感染、孕酮介导的卵母细胞成熟、cAMP信号通路、破骨细胞分化、FoxO信号通路、黑色素瘤和乙型肝炎等信号通路。见图3。

图3 预后miRNA靶基因信号通路富集分析

3 讨论

研究表明miRNA参与调控癌细胞的增殖、分化、迁移和侵袭等生物学过程，miRNA可以抑制癌基因或抑癌基因的表达，miRNA通常调控1个或多个靶基因而形成复杂的调控网络，在癌症的发生发展中扮演重要角色[6]。近年来，大量研究报道了胃癌相关miRNA标志物及相关机理，如Zhu等发现miR-6165在胃癌组织中低表达，靶向调控STRN4表达上调进而促进胃癌细胞迁移和侵袭[7]。又如Ting等报道发现，胃癌来源的外泌体中miR-155可以抑制靶基因c-MYB表达同时上调VEGF表达，促进胃癌增殖、转移和血管生成[8]。此外Bie等发现晚期胃癌患者血清中miR-191和miR-425是FOLFOX化疗敏感性独立预测因子[9]。这些研究表明miRNA参与胃癌细胞增殖、分化、转移和耐药等一系列过程，是胃癌潜在的预后因子。

本研究基于TCGA数据库筛选与胃腺癌预后相关的miRNA，利用Cox回归分析构建了基于14-miRNA的胃腺癌预后风险评分模型，AUC面积为0.793，表明该模型的预后预测效果较好。本研究筛选到hsa-mir-184、hsa-mir-7-1、hsa-mir-541、hsa-mir-597、hsa-mir-676、hsa-mir-3143、hsa-mir-450a-1和hsa-mir-1911等胃癌预后风险因素，其中hsa-mir-184在乳腺癌[10]、肾癌[11]、胶质瘤[12]和肝细胞癌[13]等多种癌症中高表达，通过上调c-Myc、SND1等基因表达促进细胞增殖和转移；先前的研究发现hsa-mir-184在胃癌中高表达且与胃腺癌的预后不良相关[14]，与本研究结果一致，但分子机制仍不明确；研究发现miR-7-1是多种癌症中的抑癌因子，抑制miR-7-1生成可以激活其靶基因如EGF受体蛋白表达，进而促进肝癌细胞增殖[15]。相反，本研究结果提示miR-7-1可能是促癌因素，其在胃癌中的作用仍需进一步探究；另有研究表明，hsa-mir-541可以通过调控TMPRSS4表达抑制肝癌细胞转移和EMT[16]，但本研究表明hsa-mir-541可能具有促癌作用。此外，本研究结果表明hsa-mir-3648、hsa-mir-7-2、hsa-mir-362、hsa-mir-3161、hsa-mir-3610和hsa-mir-320c-2等miRNA为潜在的抑癌因子。研究发现hsa-mir-3648可以靶向TCF21基因促进胆管癌增殖[17]，hsa-mir-362与多种癌症相关。Wei 等采用miRNA芯片筛选顺铂敏感的人胃癌细胞株SGC7901与相应的顺铂耐药细胞株SGC7901/DDP之间差异miRNA发现，hsa-mir-362在SGC7901/DDP细胞中低表达，进一步研究发现miR-362-5p通过靶向SUZ12增加顺铂敏感性，促进细胞凋亡，提示miR-362-5p是抑癌因子[18]。miRNA与靶基因作用是复杂的，可能通过1个或多个miRNA调控1个或多个靶基因，从而形成复杂的调控网络，基于生物信息学手段结合数据库的大样本量分析可以更系统地展示miRNA与癌症发生发展的关系，及其调控的潜在信号机制。本研究中对miRNA靶基因的KEGG富集分析得到多种癌症相关信号通路，如细胞衰老、胶质瘤、非小细胞肺癌、cAMP信号通路、FoxO信号通路、黑色素瘤、肝癌、VEGF信号通路、胃癌和mTOR信号通路，其中FoxO、VEGF和mTOR等信号均为肿瘤细胞增殖和转移相关信号通路[10-21]。此外还有脂质和胆汁酸相关代谢通路，表明这些miRNA可能通过影响胃癌细胞增殖信号进而影响预后，具体分子机制有待进一步研究。

综上所述，基于大样本量数据筛选胃癌预后miRNA并预后评估模型具有潜在的临床应用价值，胃癌预后相关miRNA通过多种机制参与胃癌调控，相关机制有待进一步探究与验证。