口腔鳞状细胞癌外周血循环肿瘤细胞检测及其临床意义

张帅源 秦硕 李光辉 易雅群 付昊杰 高雅靖 孙明磊

郑州大学第一附属医院口腔颌面外科，郑州450052

口腔颌面部恶性肿瘤是全球十大恶性肿瘤之一，其中约90%为鳞状细胞癌，其次为腺性上皮癌，间叶组织来源肿瘤少见[1]。过度饮酒、吸烟、咀嚼槟榔、不良习惯及长期物理化学因素的刺激是口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）最主要的发病因素，近年来有文献[2-4]报道人乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）也与OSCC发病有关。肿瘤的转移和复发是影响患者预后最主要因素，随着手术与放、化疗等医疗手段的进步，OSCC患者的预后虽得到相当的改善，但5年生存率仍低于50%[5]，因此寻找一种更为简便且有效的临床评价指标尤为重要。

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是一种有远处转移倾向的，短暂的肿瘤转移前体细胞。在1869年由Thomas Ashworth提出，他发现肿瘤患者血液里存在与自身瘤体相同的细胞组织，该发现后续在1954年被Watanabe等证实。CTCs与肿瘤转移关系密切[6]，由于CTCs本身来源于肿瘤组织，与肿瘤组织具有相同的遗传物质[7]，将其用于肿瘤的识别和定性，特异性极高[8]。但是外周血中的CTCs含量极少，检测难度较高，理想的CTCs检测方法必须能够分离并检测所有异质CTCs，同时丢弃正常血细胞的大背景[9]。随着检测技术的进步，最新的阴性富集及靶向聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测技术成功解决了上述问题，该方法基于CTCs与正常血细胞表面抗原CD45＋之间的表达差异，利用免疫磁珠将两者分离并最大限度的将CTCs纯化，大幅提高了检测质量[10]，这使CTCs在恶性肿瘤的辅助诊断、判断疗效和预后等方面受到越来越多的关注[9]。但目前CTCs与OSCC相关性的研究报道较少见。叶酸受体（folate receptor，FR）是一组跨膜蛋白，分为α、β和γ三种亚型，由于FR在人体大部分的肿瘤细胞中都有特异性高表达，如卵巢癌、肺癌，而在正常组织中少有表达，是一种理想的CTCs检测靶点[11]。据文献[12]报道，OSCC组织中亦可见FR高表达，本研究应用的阴性富集及靶向PCR（FR+CTC）检测技术即利用该点，以肿瘤表面FR为靶点，检测OSCC患者外周血的CTCs，分析其与肿瘤患者病理分期、病理亚型、淋巴结转移、分化程度、临床分期等临床病理特征间的关系，探讨CTCs检测的价值和应用前景。

1 材料和方法

1.1 一般资料

选择2019年5月—2020年5月在郑州大学第一附属医院确诊的93例OSCC患者为试验组，同期选取20例健康志愿者为对照组。试验组中，男64例（68.8%），女29例（31.2%），年龄25～78岁，平均年龄（51.50±12.53）岁；对照组中，男9例（45%），女11例（55%），年龄22～69岁，平均年龄（44.60±12.66）岁。

本研究纳入标准：1）病理诊断为鳞状细胞癌；2）除OSCC外无其他部位原发恶性肿瘤以及严重全身性疾病；3）入院前未接受放化疗及手术等其他相关治疗。排除标准：1）入院前曾接受放化疗及手术等其他相关治疗；2）严重感染或肝肾功能严重异常；3）生活不能自理或不能配合治疗者。

1.2 CTCs的富集与检测

CTCs的检测采用负向富集及靶向PCR检测技术。严格遵循采血标准，取患者3 mL静脉血，血样中加入红细胞裂解液孵育，红细胞裂解后离心，加入CD45+磁珠结合白细胞，用磁场捕获并去除白细胞，剩余富含CTCs的细胞群，加入特异性探针（针对表达FRα的细胞设计，由靶向FR的叶酸单元与共价偶联的寡核苷酸单元组成）标记CTCs，离心，去除上清液游离探针，加入洗脱剂，洗脱与CTCs特异性结合的探针，制备待测样品，加入PCR扩增试剂后进行荧光实时PCR扩增（PCR扩增模板的寡核苷酸单元序列为：5’-CTCAACTG‐GTGTCGTTGGGCAATTCAGTTGATTCTAA-3’），经数据分析，计算出3 mL血样中CTCs的含量。

1.3 统计学方法

采用R4.0.0（R Foundation for Statistical Com‐puting，澳大利亚）统计软件进行数据分析，单组间比较使用了Kruskal-Wallis检验，多组间使用Mann-Whitney U检验。采用受试者工作曲线（re‐ceiver operating characteristic curve，ROC）分析外周血CTCs对OSCC相关的诊断价值，并通过其敏感度和特异性来计算约登指数。多因素分析采用线性回归模型。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组外周血CTCs值的比较

OSCC患者的术前CTCs值中位数=10.8，四分位范围=[9.7，13.6]，对照组的CTCs值中位数=8.00，四分位范围=[7.67，8.10]，试验组显著大于对照组（P＜0.000 1）（图1）。

图1 OSCC组与对照组CTCs的比较Fig 1 Comparison of CTCs values between OSCC group and the control group

2.2 外周血CTCs与OSCC临床病理特征的关系

外周血CTCs与患者的性别、周围组织浸润、发病部位等无关（P＞0.05）。与患者的年龄（P=0.022）、OSCC的分化程度（P＜0.001）、淋巴结转移（P=0.006 4）、肿瘤T分期（P=0.02）、N分期（P=0.007 5）及临床分期（P=0.029）、早晚期相关（P=0.022）等相关，差异均有统计学意义（P＜0.05）。M1期患者CTCs值较M0期显著增高，Ⅲ+Ⅳ期患者CTCs值高于Ⅰ+Ⅱ期者，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1、图2）。

图2 CTCs与OSCC临床病理特征的关系图Fig 2 The relationship between CTCs and clinicopathological features of OSCC patients

表1 OSCC患者外周血CTCs与临床病理特征的关系Tab 1 The relationship between CTCs and clinico‐pathological features of OSCC patients

2.3 CTCs诊断价值分析

2.3.1 外周血CTCs检测对OSCC的诊断价值 应用CTCs诊断OSCC的AUC值为0.925，检验能效性有统计学意义[P=0.000，95%CI（0.876，0.974）]，当CTCs值为8.450 FU/3 mL时，约登指数最大为0.853，敏感度90.3%，特异性95.0%（图3）。

图3 CTCs用于诊断OSCC的ROC曲线Fig 3 The ROC curve of CTCs in diagnosis of OSCC

2.3.2 外周血CTCs检测对OSCC转移的诊断价值应用CTCs诊断OSCC转移的AUC值为0.691，检验能效性有统计学意义[P=0.000，95%CI（0.580，0.803）]，当CTCs值为12.250 FU/3 mL时，约登指数最大为0.367，敏感度63.6%，特异性73.3%（图4）。

图4 CTCs用于诊断OSCC转移的ROC曲线Fig 4 The ROC curve of CTCs in diagnosis of OSCC metastasis

2.4 CTCs与OSCC患者临床病理特征之间的多因素回归分析

将单因素分析中P＜0.2的变量全都纳入到了多因素线性回归模型中。纳入的变量包括性别、年龄、发病部位、分化程度、周围组织浸润、淋巴结转移、T分期、N分期、M分期以及临床分期等。使用逐步回归法筛选变量，得到以下模型。肿瘤原发于颊部与OSCC患者CTCs值呈负相关（P=0.001 08）；N2分期（P=0.000 74）及M分期（P=0.026 38）与OSCC患者CTCs值呈正相关；肿瘤分化程度中高分化（P＜0.000 1）和中分化（P=0.001 5）与OSCC患者CTCs值呈负相关，分化越高，CTCs值越低。

表2 CTCs与OSCC患者临床病理特征之间的多元素回归分析Tab 2 Multielement regression analysis of clinicopathological features between CTCs and OSCC patients

3 讨论

在OSCC临床诊治中发现有部分TNM分期较早的患者，虽无远处转移证据，并接受了根治性手术，但仍在一段时间后发生了肿瘤的复发或转移，考虑这部分早期OSCC患者术前已发生了微转移，此前常规的术前临床检查手段并不能及时发现肿瘤的亚临床病灶[13]，随着医疗水平的提高，近年来应用CTCs等“液体活检”技术为筛查OS‐CC提供了新的思路[14-16]。

CTCs是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体瘤病灶脱落，进入外周血循环的肿瘤细胞，并可以在一定条件下发展为转移灶[17]。肿瘤释放至外周血中CTCs的多少，可直接的反映出肿瘤发生、发展的功能状态。在乳腺癌[18]、肺癌[19]等肿瘤中，CTCs已成为了较可靠的肿瘤标记物，用于评估患者的治疗效果、无进展生存期和预后[20]。CTCs在口腔颌面部肿瘤中的研究起步稍晚，Buglione等[21]研究表明CTCs在头颈部肿瘤患者中表达水平与肿瘤分期、肿瘤负荷、淋巴结及远处转移这些高危参数显著相关。

目前CTCs检测方法较多，各类方法灵敏度及特异性参差不齐。本研究采用的阴性富集及靶向PCR检测技术较为先进，有较高的临床参考价值。通过检测，单因素分析中OSCC患者外周血CTCs与健康人群相比明显升高，表明CTCs值的升高与肿瘤发生密切相关，有助于肿瘤的早期诊断，这与其他学者[22]的研究一致。在CTCs与OSCC临床特征关系的研究中发现，≥60岁组患者的CTCs值明显较高，考虑可能与该组患者中Ⅳ期占比较高（48%）有关，说明年龄为OSCC危险因素之一，老年患者更应密切随访，这是肿瘤治疗过程中关键步骤。在外周血CTCs与OSCC临床病理指标的相关性研究中发现，CTCs与OSCC的分化程度相关，肿瘤分化程度越低，恶性程度越高，外周血CTCs值越高，反之亦然，笔者认为可能是因为恶性程度高的肿瘤更易侵入小血管壁，从而更易发生血行转移。OSCC组患者中，外周血CTCs值随T分期、N分期增高而呈总体上升趋势，淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，M1期组高于M0期组，表明外周血CTCs水平与肿瘤大小、淋巴结转移及远处转移等临床病理指标密切相关，临床上遇到CTCs检测值较大的患者，医生应尽可能完善相关检查，确定肿瘤负荷大小，有无临床转移迹象，明确手术适应证。另外CTCs与有无肿瘤周围组织浸润之间虽差异无明显统计学意义，但有肿瘤周围组织浸润组CTCs值较无浸润组增高，考虑可能由于样本量不足导致偏倚，后续笔者将扩大样本量进一步比较。在CTCs与临床分期的关系研究中也发现，CTCs与患者临床分期相关，发现Ⅲ+Ⅳ期患者的CTCs值较Ⅰ+Ⅱ期者明显升高，这与周士超等[23]的研究结果相一致，表明通过检测CTCs值有助于辅助判断患者临床分期，对OSCC临床诊疗有一定的指导意义。由于仅依靠单因素分析，各变量的真实效应有可能被其他混杂变量所掩盖，因此增加了多因素分析控制偏倚，通过推导CTCs与OSCC之间的线性回归方程得出颊部，N2分期，M分期，中、高分化程度等因素均为OSCC患者术前CTCs的独立影响因素。以上结果表明检测CTCs有助于判断肿瘤的恶性程度、进展情况、病理分级，CTCs值可一定程度反映出肿瘤的活跃程度和疾病的进展程度，可成为较为可靠的肿瘤监测指标之一。本研究通过对照组和OSCC组CTCs值绘制ROC曲线，计算出应用CTCs值诊断OSCC的AUC值为0.925，通过其敏感度及特异性计算出其约登指数为0.853，所对应的外周血CTCs值为8.450 FU/3 mL，敏感度与特异性均＞90%，有较高的检验效能和临床诊断价值。将其应用于OSCC的筛查和辅助诊断，当CTCs检测值＜8.450 FU/3 mL时，有较小患癌可能，若高于此值，则需密切随访或行必要的检查来排查患癌可能。同样通过转移组与未转移组之间CTCs值绘制ROC曲线，评估CTCs对OSCC转移的诊断价值，计算出AUC值为0.367（P=0.000），约登指数为0.44，相对应的CTCs值为12.250 FU/3 mL，敏感度为63.6%，特异性为73.3%，当OSCC患者CTCs值＞12.250 FU/3 mL时有较大转移可能，具有一定的转移预测价值。

本研究结果表明，CTCs的检测对于OSCC的早期筛查、辅助诊断及转移预测等均具有重要的临床意义。本研究也存在一定不足，由于随访时间较短，未能进行完整的预后分析，后续将加强随访，进一步探讨CTCs对OSCC预后评估的价值。

综上所述，外周血CTCs的检测，对OSCC的早期筛查、辅助诊断、评估转移以及判断肿瘤的恶性程度，进展情况、病理分级等均有较为重要的临床价值，是一个较为可靠的肿瘤检测指标。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。