2种干燥方式对樟叶越桔3种主效成分含量的影响

李国泽 陈蔼仪 李 雪 赵 平 陆燕元 丁 勇

（1. 西南林业大学云南省高校林木生物技术重点实验室，云南 昆明 650233；2. 西南林业大学西南地区林业生物质资源高效利用国家林业与草原局重点实验室，云南 昆明 650233）

樟叶越桔（Vaccinium dunalianum）为杜鹃花科（Ericaceae）越桔属常绿稀攀援灌木，又名饭米果（云南昆明），长尾越桔等，其国外主要分布于尼泊尔（东部）、锡金、不丹、印度（东北部）、缅甸（北部）至越南（北部），国内主要分布于四川、贵州、云南（西北部经滇中高原至滇南、滇东南）、西藏等地区[1-3]。樟叶越桔全株入药，性味微苦，微温，具有祛风除湿、舒筋活络、治疗风湿关节疼等药用功能[3]。云南滇中地区（武定县、禄劝县、巍山县等）樟叶越桔野生资源丰富，楚雄彝族人民利用其幼嫩叶芽制成具有传统特色的雀嘴茶，其茶汤清透明亮，香气馥郁，滋味回甘悠长，是彝族民间常用的一种茶代用品[4]。

近年来，对樟叶越桔植物的研究主要集中在其营养成分[5-8]、主效成分[5-6,9-12]和重要性状功能基因[13-20]等方面，研究发现樟叶越桔中不仅含有丰富的氨基酸、蛋白质、粗纤维、黄酮类、Vc和多糖等多种营养物质[5-8]，还富含熊果苷、绿原酸和6′-O-咖啡酰熊果苷（CA）[5-6,9-12]3种主效活性物质。2008年，Zhao等[9]首次从樟叶越桔‘雀嘴茶’中分离得到9个咖啡酰熊果苷类衍生物以及相关酚苷类化合物共29种，其中熊果苷、绿原酸和CA为主要的3种化合物，而CA干质量含量高达22%；Luo等[10]发现CA、绿原酸和熊果苷分别以干质量31.76%、7.61%和2.81%的含量存在于云南野生樟叶越桔叶芽中。樟叶越桔不仅可作为皮肤美白活性剂原料熊果苷及其衍生物类物质CA的天然来源植物[9-10]，其富含的主效活性物质还具有预防心血管疾病[21-22]、降血脂、胆固醇和抗血栓[23]、抗菌、镇咳、利尿和消炎等[24-26]多种药用功效。因此开展樟叶越桔主效成分高效提取的相关研究则显得愈发重要。前期李娜等[11]对樟叶越桔叶芽加工品雀嘴茶（购自云南省武定县干燥成品）CA的提取工艺进行优化，发现提取次数、液料比、超声时间和甲醇体积分数等因素影响着CA含量的高效提取；谭亚婷等[12]研究了不同生长素类型及浓度影响樟叶越桔离体茎段和叶片的组培培养物中熊果苷和CA的含量差异，表明NAA或IBA可作为樟叶越桔组培苗离体叶片产生熊果苷和CA的诱导子，认为樟叶越桔组培苗叶片是离体生产熊果苷和CA的潜在理想原料。但在樟叶越桔已知研究中，均未报道不同干燥方式对熊果苷、绿原酸和CA等主效成分含量的影响。不同干燥方式也会对植物产品物理特性及化学成分存在不同程度的影响[27-33]。关于樟叶越桔化合物成分提取相关研究中，为了节约时间对组织样品的干燥方式通常采用热风干燥（HAD）。而通过研究发现对于同一樟叶越桔组织样品，相比HAD，采用自然风干（NAD）干燥方式处理，可获得更高的主效成分提取含量，现予以报道。为樟叶越桔主效成分的开发利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验植物材料采自云南省楚雄州武定县不同地点的野生樟叶越桔植物成熟叶片、幼嫩叶片和鲜新花芽，见图1。成熟叶片为枝条顶端以下第2～4片中无虫蛀、无斑点的随机2片，幼嫩叶片新鲜、健康，花芽生长良好、大小匀称，组织样品装入信封袋带回实验室进行干燥处理试验，供试样品信息见表1。

表1 供试植物样品信息Table 1 Information of plant samples tested

图1 试验植物材料樟叶越桔及不同组织部位Fig. 1 Experiment plant materials of V. dunalianum and its different tissues

1.2 试剂

标准品熊果苷（批号：T17S6B1）和绿原酸（批号：Y22M8K36544）均购自上海源叶生物科技有限公司，6′-O-咖啡酰熊果苷（CA）为课题组采用化学方法从樟叶越桔中提取分离，纯度＞95%；色谱纯甲醇为德国Merck公司产品；分析纯甲醇、冰乙酸产自天津市大茂化学试剂厂；水为超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1样品干燥试验处理

将表1中各组织样品随机分为2份，每份10 g，一份用于HAD试验，另一份用于NAD试验。1）HAD试验处理：将样品装在铝质干燥盒中，置于电热恒温鼓风干燥箱（上海市试验仪器总厂LG100B型理化干燥箱）内，45 ℃条件下连续干燥至恒质量（叶和花芽组织分别约用34 h和42 h）。2）NAD试验处理：将样品单层平铺于白纸上，在实验室内阴凉通风处干燥至恒质量（约20 d），室温平均约25 ℃。样品恒质量方法为采用SOP型电子分析天平（德国Sartorius公司）称量，使相邻两次称量质量之差在千分之五以内。

1.3.2 样品主效成分提取预处理

取干燥后的试验样品粉碎过40目筛，密封于50 mL离心管后再置于黑色封口袋中。测定化合物含量前，将样品置于干燥器中平衡过夜。

1.3.3 HPLC试样制备

1）混合标准品溶液制备。准确称取熊果苷、绿原酸和CA 3种标准品，先配制成起始质量浓度为1.20 μg/μL熊果苷、3.00 μg/μL绿原酸和6.00 μg/μL CA的标准品溶液，再依次等体积稀释，至终质量浓度为0.02 μg/μL熊果苷、0.05 μg/μL绿原酸以及0.09 μg/μL CA标准品溶液（表2）。

2）供试样品溶液制备。精确称取1.3.2预处理后的样品0.10 g，3个重复。参照文献[11]的方法，按液料比16∶1加入73%甲醇提取剂，LU10AT型超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）超声辅助提取19 min，CF16RXⅡ型台式高速冷冻离心机（日本HITACHI公司）离心沉淀（5 000 r/min离心2 min）后，取上清，沉淀再按液料比16∶1加73%甲醇（同法重复3次，共提取4次），各取提取液1 mL等体积混匀，过0.45 μm滤孔滤膜（一次性针头式过滤器）后注入棕色色谱小瓶。

1.3.4 HPLC标准曲线的建立

不同浓度的标准品参照文献[34]进行HPLC测定分析。色谱条件：色谱柱为F90104 CAPCELL PAK C18 MG（S-5）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A相为1%冰乙酸，B相为色谱纯甲醇；梯度洗脱程序见表3；流速为1 mL/min；柱温25 ℃；进样量为10 μL；检测波长为280 nm，依次进样（美国Waters公司Waters 2695超高效液相色谱仪），以标准样品溶液浓度（μg/μL）为横坐标（X），对应的峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析，计算回归方程。

表3 HPLC梯度洗脱程序Table 3 The gradient elution program used in HPLC

1.3.5样品测定

将1.3.3制备好的供试样品溶液，在上述色谱条件下分别进样，进行熊果苷、绿原酸和CA 3种主效成分含量测定，记录峰面积，代入线性回归方程，计算3种主效成分在不同组织样品中的含量。

1.3.6 数据处理

采用Excel 2010处理试验数据，测定结果以平均值±标准差表示；用SPSS 21.0软件进行单因素ANOVA方差分析（Duncan法和LSD法）。

2 结果与分析

2.1 HPLC标准曲线的建立

根据标准品浓度对应的峰面积，获得了熊果苷、绿原酸和CA的标准曲线（表4）。结果显示3种化合物标准曲线的R2均大于0.999，呈现较好的线性关系。

表4 标准品线性回归方程Table 4 Linear regression equation of standard

2.2 2种干燥方式对成熟叶片3种主效成分含量的影响

2种干燥方式处理后樟叶越桔成熟叶片组织4个样品中3种主效成分含量见表5，显示同一样品中，CA、绿原酸和熊果苷在NAD处理下的含量均显著高于HAD处理的，且差异均达到了极显著水平（P＜0.01）。在4个成熟叶片样品中，NAD处理的CA含量是HAD处理的4.50～19.46倍，其中ML-ZX样品差异最高，ML-YQ样品差异最低；NAD处理的绿原酸含量是HAD处理的4.04～9.49倍，其中ML-XC-02样品差异最高，ML-YQ样品差异最低；NAD处理的熊果苷含量是HAD处理的1.38～5.63倍，其中ML-XC-01样品差异最高，ML-YQ样品差异最低。表明NAD和HAD 2种不同干燥方式显著影响樟叶越桔成熟叶片组织中3种主效成分的提取含量，NAD处理的高，HAD处理的低。

表5 2种干燥方式处理下樟叶越桔成熟叶片中3种主效成分含量（n=3）Table 5 Contents of 3 main effective ingredients in mature leaves of V. dunalianum after drying by 2 different methods (n=3)

NAD和HAD 2种不同干燥方式还影响着樟叶越桔成熟叶片组织中3种主效成分含量的高低顺序规律。图2显示，NAD处理的所有成熟叶片样品中3种主效成分含量均表现稳定的高低规律，为CA＞绿原酸＞熊果苷。HAD处理下，样品ML-XC-01和ML-YQ中3种主效成分含量高低规律表现出与NAD处理的一致，但在样品ML-XC-02和ML-ZX中则表现为绿原酸＞CA＞熊果苷的高低顺序；且同一采样地新村村的2个样品ML-XC-01（CA＞绿原酸＞熊果苷）和MLXC-02（绿原酸＞CA＞熊果苷）3种主效成分含量高低规律也不同。表明NAD比HAD处理获得的樟叶越桔成熟叶片组织中3种主效成分含量的高低规律更稳定。

图2 樟叶越桔成熟叶片3种主效成分在不同干燥方式处理下和不同采样地中的含量变化Fig. 2 Changes in the contents of 3 main effective ingredients in mature leaves of V. dunalianum under different drying methods and in different sampling sites

NAD和HAD干燥方式下，同一主效成分在不同样品中的含量也表现出不同的高低顺序。由图2可知，NAD处理下，CA含量高低顺序为ML-XC-01＞ML-ZX＞ML-YQ＞ML-XC-02，绿原酸含量高低顺序为ML-XC-01=ML-ZX＞ML-YQ＞ML-XC-02，熊果苷含量高低顺序为ML-XC-01＞ML-ZX＞ML-XC-02＞ML-YQ；而HAD处理下，CA和绿原酸含量高低顺序均为ML-YQ＞MLXC-01＞ML-ZX＞ML-XC-02，熊果苷含量高低顺序 为ML-YQ＞ML-XC-02＞ML-XC-01＞ML-ZX；除在ML-XC-01和ML-ZX样品中，HAD处理下熊果苷含量和NAD处理下的绿原酸含量在0.05水平无显著差异外，各主效成分含量在不同样品中均表现出显著差异（P＜0.05）。表明NAD和HAD 2种不同干燥方式也影响着各主效成分在不同采样地樟叶越桔成熟叶片组织中含量的变化规律。

2.3 2种干燥方式对不同组织部位3种主效成分含量的影响

应用NAD和HAD 2种干燥方式处理樟叶越桔幼嫩叶片和花芽，结果（表6）显示在幼嫩叶片和花芽组织中，CA、绿原酸和熊果苷在NAD处理下的含量均显著高于HAD处理的（P＜0.05），这与成熟叶片组织中的结果一致。在幼嫩叶片TL-HP样品中，NAD处理的CA、绿原酸和熊果苷的含量分别是HAD处理的2.35、8.72、1.43倍；在花芽FB-ZX样品中，NAD处理的CA、绿原酸和熊果苷的含量分别是HAD处理的22.88、10.63、1.18倍。同时，幼嫩叶片和花芽组织中CA和绿原酸含量在NAD和HAD处理间也达到了极显著差异（P＜0.01）。表明NAD处理下樟叶越桔不同组织3种主效成分提取含量均显著高于HAD。

表6 2种干燥方式处理下樟叶越桔不同组织部位3种主效成分含量（n=3）Table 6 Contents of 3 main effective ingredients in different tissues of V. dunalianum after drying by2 different methods (n=3)

樟叶越桔幼嫩叶片和花芽组织中3种主效成分含量的高低顺序规律同样受NAD和HAD 2种不同干燥方式的影响。NAD处理下，TL-HP和FB-ZX样品中3种主效成分含量均表现为CA＞绿原酸＞熊果苷（图3），这与在成熟叶片组织中呈现的高低规律性（图2）相一致。HAD处理下，3种主效成分在TL-HP和FB-ZX样品中却表现出不同的含量高低顺序，前者同NAD处理，后者为绿原酸＞CA＞熊果苷。表明不同干燥方式影响樟叶越桔3种主效成分含量高低顺序，NAD处理下不同组织中均表现出CA＞绿原酸＞熊果苷的稳定规律，稳定性强于HAD处理。

图3 樟叶越桔幼嫩叶片和花芽中3种主效成分含量受不同干燥方式处理的变化Fig. 3 Changes in the contents of 3 main effective ingredients in tender leaves and flower buds of V. dunalianum under different drying methods

3 结论与讨论

干燥是植物加工过程中常见的方法，不同干燥方式会对植物产品物理特性及化学成分存在不同程度的影响[27-33]。NAD和HAD是被普遍应用，且操作较简便、易行的2种干燥方式。研究表明，相比HAD，NAD是保存甜藤（Paederia scandens）茎中黄酮成分[29]、橘（Citrus reticulata）皮中黄酮成分[30]和喜树（Camptotheca acuminata）果中喜树碱[31]等化学成分高含量的合理方法。本研究发现NAD在保存樟叶越桔叶和花芽等不同组织部位中CA、绿原酸和熊果苷3种主要化学成分含量方面显著优于HAD。同样NAD法处理获得的金银花（忍冬）（Lonicera japonica）叶[35-36]、杜仲（Eucommia ulmoides）叶[37]和皮[38]、猪毛蒿（Artemfsfa scoparia）[39]和亳菊（Dendranthema morifolium）[40]等不同材料、不同组织中的绿原酸含量也均高于HAD。推测HAD中加热温度和时间会降低多种植物材料中活性成分含量。

张群等[33]研究表明HAD中热风温度（50、65、80 ℃）越高，蓝莓（越桔）（Vaccinium vitisidaea）果干中总酚和花青素损失越多，HAD处理会使酚类物质氧化、集合或分解，从而导致酚类物质含量下降，而花青素在高温环境下也极易分解。温度同样会影响熊果苷和绿原酸的稳定性。熊果苷[41-42]在常温下较稳定，30～40 ℃温度区间内，熊果苷的活性可达最佳，温度高于40 ℃，其水溶液极易分解产生对苯二酚。绿原酸的分子结构中具邻位酚羟基，易在多酚氧化酶的作用下氧化缩合成高分子有色物质，在一定温度范围内，随干燥温度的升高，多酚氧化酶活性增强，加速绿原酸的氧化与缩合，导致其含量不断降低[35-37]；绿原酸还是多酚羟基酸性物质，热稳定性差，也会受温度的影响而分解损失[43-44]。本研究结果也表明45 ℃的HAD相比室温的NAD会显著降低樟叶越桔不同组织部位中的熊果苷和绿原酸的含量，另外CA含量也显著下降且下降幅度大于绿原酸和熊果苷。推测CA作为熊果苷的衍生物，其稳定性可能受温度的影响更大，在长时间HAD（45 ℃）干燥过程中CA极不稳定、易降解。建议在以樟叶越桔主成分开发利用为目的的生产过程中不宜在过高的温度下进行投料。

樟叶越桔叶芽和花芽是其3种主效成分分布较集中的部位[34]。本研究采用NAD处理的武定产野生樟叶越桔3种主效成分含量在不同组织部位中表现为花芽＞成熟叶片＞幼嫩叶片，这符合已知研究结果[34]。而相对于花芽和叶芽，樟叶越桔叶片资源充足、数量大。加大对樟叶越桔叶片的研究，一方面可以丰富3种主效成分提取的原材料，另一方面在一定程度上可减少对能产生经济效益的花芽、叶芽野生资源的消耗。本研究对不同地点樟叶越桔野生资源调查和成熟叶片的研究发现，优选的NAD处理的成熟叶片ML-XC-01样品中3种主效成分含量约为已知报道含量[34]的2倍，尤其是CA干质量高达13.61%（表5），提示这为今后樟叶越桔种质资源质量评价、高含量CA优良单株资源选育及育种等工作提供了方法和途径。

综上所述，NAD和HAD 2种不同干燥方式影响着樟叶越桔不同组织中CA、绿原酸和熊果苷3种主效成分保存含量及含量高低顺序规律，NAD处理的3种主效成分提取含量显著高于HAD（45 ℃）的，樟叶越桔体内3种主效成分含量高低顺序在NAD处理下更稳定，在不同组织中一致表现为CA＞绿原酸＞熊果苷的规律。建议在主效成分开发利用的研究中避免选用HAD对樟叶越桔样品进行干燥处理。本研究为后续开展樟叶越桔各组织部位其他干燥方式以及多种干燥方式联合的研究提供一定的参考依据，相信随着研究的深入，对于樟叶越桔不同组织部位干燥的方法将会得到进一步的创新。