自拟补肾活血方联合重组人粒细胞刺激因子治疗免疫性复发性流产的疗效分析

谢春红，梁松岳，钱平，彭艳丽，谢锂岑

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是育龄期妇女流产常见的病因之一，目前RSA定义尚无统一标准，我国将RSA定义为同一性伴侣在妊娠28周前发生3个或3个以上的妊娠丢失[1]。RSA病因复杂，目前已知涉及遗传、解剖异常、内分泌紊乱、感染、免疫功能紊乱、血栓前状态、环境因素等[2]。近年来随着生殖医学的发展，免疫因素所致RSA逐渐引起关注，母体免疫系统紊乱可诱发自身抗体的产生，细胞因子分泌异常，导致母体对胎儿免疫排斥反应，最终发生流产[3]。西医对免疫性RSA的治疗主要包括内分泌治疗、主被动免疫治疗、免疫抑制治疗等，虽然取得一定疗效，但是长期使用存在出血、肝肾功能受损等不良反应。补肾活血方具有补肾活血、益气养血、清热安胎之功效，并能调节RSA患者免疫耐受状态[4]。因此，本研究通过临床随机对照试验，客观评价补肾活血方联合重组人粒细胞刺激因子治疗免疫性RSA的疗效，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年3月—2020年3月湖南省妇幼保健院中医妇科门诊收治的免疫性RSA患者96例，按照随机数字表法分为对照组和观察组，每组各48例。观察组年龄(30.16±3.59)岁，体质量指数(23.15±2.35)kg/m2，孕次(5.32±1.62)次；流产(4.05±1.03)次；对照组年龄(29.74±3.18)岁，体质量指数(22.45±2.49)kg/m2，孕次(5.28±1.57)次；流产(3.98±1.01)次。年龄、孕次、流产次数、体质量等临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(审批号：20170105)，患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 纳入标准：(1)符合《妇产科学》中RSA诊断标准[5]；(2)2次免疫因素检查提示自身抗体(封闭抗体或抗磷脂抗体、抗精子抗体、淋巴细胞抗原相容性等)阳性者；(3)中医证型为肾虚血瘀型，主症，屡孕屡堕，次症，双膝酸软、头晕耳鸣、夜尿频多、神疲乏力，舌质淡，苔薄白，伴瘀斑，脉沉细或涩[6-7]；(4)距离上次流产>3个月，年龄<40岁。

排除标准：(1)妊娠期间因不可抗力或环境因素先兆流产或流产者；(2)性激素水平、甲状腺功能异常；(3)生殖系统畸形或解剖学异常；(4)生殖道弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒感染；(5)近1个月服用其他中药治疗和激素类药物，治疗期间擅自停药。

1.3 治疗方法 对照组：分别于排卵前1、2 d和排卵日于医院门诊接受重组人粒细胞刺激因子注射液(瑞白，齐鲁制药有限公司生产)300 μg皮下注射治疗，连续治疗2个周期。治疗期间禁止性生活，注意休息，补充维生素E和叶酸。治疗结束受孕后口服屈孕酮片(荷兰Abbott Biologicals B.V.公司生产)10 mg，每天2次，维持治疗至妊娠12周。

观察组：在对照组基础上增加自拟补肾活血方治疗。方剂组成：菟丝子15 g，桑寄生15 g，续断15 g，杜仲15 g，生地10 g，丹参10 g，川芎10 g，益母草6 g，当归12 g，白芍12 g，黄芩10 g，柴胡6 g，白术12 g，黄芪 30 g。辨证加减：少腹坠胀加升麻 10 g，苏梗10 g；阴道出血加荆芥炭 12 g，地榆炭15 g；腹痛加砂仁6 g，陈皮12 g。中药及煎制由医院中药房提供和完成。服用方法：每日水煎剂1剂，分早晚2次服用，自入组后开始服用自拟补肾活血方，维持至妊娠。

1.4 观察指标与方法 (1)中医证候积分：参照《中药新药临床研究指导原则》[6]对治疗前后双膝酸软、头晕耳鸣、夜尿频多、神疲乏力等证候进行评分，按无、轻度、中度、重度分别记0、2、4、6 分，分值越高提示病情越严重。(2)血浆细胞免疫检测：治疗前、治疗后采集外周静脉血6 ml分别注入肝素抗凝试管和干燥试管。含肝素抗凝试管血标本充分混匀，采用CD3-PE/CD4-FITC、CD3-PE/CD8-FITC、CD3-PE/CD56-FITC/CD16-APC抗体(购自北京四正柏生物科技有限公司)标记，FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD公司)检测CD3+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞(CD3-CD56+NK细胞)及其亚群[CD56brightNK细胞(CD3-CD56+CD16+)，CD56dimNK细胞(CD3-CD56+CD16-)]所占百分比。(3)血清炎性因子指标检测：普通干燥试管中待血液凝固后取上层液离心(3 000 r/min，半径10 cm，时间10 min)后取血清待测。采用ALISEI全自动酶标仪(意大利SEAC公司)应用酶联免疫吸附试验检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、C反应蛋白(CRP)水平，试剂盒购自上海酶联生物公司。(4)不良反应：观察2组患者治疗期间肝肾功能损伤、头晕、恶心、呕吐等不良反应发生情况。

1.5 疗效评价标准 依据文献[8]制定疗效标准：治愈，妊娠至20周，B超提示胎儿发育正常，临床症状和体征消失；好转，以往流产最长孕周<妊娠周期<20周，临床症状和体征有所改善；未愈，妊娠周期<以往流产最长孕周，临床症状和体征无改善或有加重。总有效率=(治愈+好转)/总例数×100%。

2 结 果

2.1 2组患者临床疗效比较 观察组患者治疗总有效率高于对照组(89.58% vs. 70.83%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 2组免疫性复发性流产患者临床疗效比较 [例(%)]

2.2 2组患者治疗前后中医证候积分比较 与治疗前比较，2组患者治疗后双膝酸软、头晕耳鸣、夜尿频多、神疲乏力等积分均降低(P<0.01)，且观察组低于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 2组免疫性复发性流产患者治疗前后中医证候积分比较分)

2.3 2组患者治疗前后血浆免疫指标比较 与治疗前比较，2组患者治疗后CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD3-CD56+NK细胞、CD56brightNK细胞、CD56dimNK细胞占比均升高(P<0.05)，且观察组治疗后各项指标高于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 2组免疫性复发性流产患者治疗前后免疫指标比较

2.4 2组患者治疗前后血清炎性因子比较 与治疗前比较，2组患者治疗后血清TNF-α、IL-1β、CRP水平降低(P<0.01)，且观察组治疗后各项指标低于对照组(P<0.01)，见表4。

表4 2组免疫性复发性流产患者治疗前后炎性因子水平比较

2.5 2组患者不良反应比较 2组患者均未出现药物过敏，也未发生肝功能损害，仅对照组出现头晕1例，观察组未观察到不良反应发生。

3 讨 论

RSA属于中医“滑胎”范畴，以“屡孕屡堕”“应期而堕”为特点，中医认为RSA病因在于冲任受损和胎元不固，与肾虚、气虚、血瘀等有关，《景岳全书·妇人规》中云“凡妊娠之数见堕胎者，必以气脉亏损而然”，肾为冲任之本，冲为血海，任主胞胎，冲任又皆起胞中，因此肾气不足可致阴阳失调，冲任不调，生殖功能减弱，胞宫无以系胎，发生堕胎，反复小产。《灵枢·邪气脏腑病形》中云“有所堕坠，恶血留内”，妇人妊娠后阴血下注冲任以养胎元，若血瘀则致冲任失盛，胎失所养，胎元不能顺利着床，起堕胎甚至屡孕屡堕，血瘀证、肾虚证分别占RSA中医证型的34.7%和32.0%[9]。现有研究显示，肾虚与免疫功能异常有关，“正气存内，邪不可干”“邪之所凑，其气必虚”，肾在免疫调节中发挥重要作用，肾虚血瘀则会破坏女性生殖系统稳态，故免疫性RSA 病机为肾虚血瘀，以虚为本，以实为标，治疗应采取补肾活血法[8，10-11]。

自拟补肾活血方中菟丝子补肝肾，滋阴固阳，桑寄生益血固胎，续断补肾安胎，杜仲补下焦之虚，4味君药共发挥滋补肝肾、稳固冲任、益母安胎之功效。配伍丹参、益母草清热凉血、活血散瘀，发挥活血化瘀安胎效果，适用于血瘀之症。加用补血活血的当归，行气开郁的川芎，助气血畅行，使胎有所养。再配伍白芍助养血柔肝、调经安胎，抑制川芎走窜之性，生地凉血补血，滋阴补肾。6味臣药活血行气，养血安胎，与滋补的君药为伍，补中带行，补行共施，补而不滞。辅以黄芩、白术安胎气，黄芪、柴胡益气升阳，令气血旺行，经络通畅，胎元得以提固。全方14味中药君臣佐使，相辅相成，共奏补肾活血安胎之效，并根据临床辨证加减，灵活使用，观察组治疗有效率达89.58%。对照组采用重组人粒细胞刺激因子皮下注射治疗，37.50%患者妊娠维持到20周，这与重组人粒细胞刺激因子治疗促使子宫内膜分化增殖，增强早期胚胎和子宫内膜黏附力，利于胎盘着床和生长，提高子宫内膜对雌激素敏感性，改善子宫内膜容受性有关[12-13]。补肾活血方也可促进滋养细胞蜕膜化和胚胎发育[14]，重组人粒细胞刺激因子皮下注射联合补肾活血方可发挥更显著的治疗效果。本研究结果显示，观察组治疗有效率高于对照组，治疗后中医证候积分低于对照组，说明在西医治疗基础上加用补肾活血方可提高免疫性RSA的疗效，改善患者临床症状。

免疫细胞参与母—胎免疫耐受的过程，正常妊娠时免疫细胞与子宫蜕膜细胞和滋养细胞相互形成完整的免疫网络，协调受精卵着床和胎儿发育，维持妊娠正常进行。当免疫调节机制紊乱，分泌大量炎性细胞因子，影响受精卵植入和胎盘形成，母胎免疫耐受异常，细胞免疫增强，对胎儿排斥反应增加，引发流产[15]。本研究结果显示，2组患者治疗后CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD3-CD56+NK细胞、CD56brightNK细胞、CD56dimNK细胞占比均增高，血清TNF-α、IL-1β、CRP水平均降低，说明重组人粒细胞刺激因子皮下注射或联合补肾活血方均可改善免疫性RSA患者免疫功能，抑制机体炎性反应。现有研究显示，重组人粒细胞刺激因子可通过效应细胞CD4+T淋巴细胞调节机体免疫状态，具有抗炎和免疫调节作用[16-17]。中医补肾活血治疗也被证实可下调 CD8+T细胞占比，上调CD4+T细胞占比，恢复免疫平衡，还可加强 NK细胞与子宫间质细胞间旁分泌途径，提高NK细胞活性，继而维持免疫内环境稳态，提高保胎效果[18-20]。其次，补肾活血方还可改善宫腔局部炎性环境，降低外周血白介素-1β和白介素-23水平[21-22]。现代基础研究显示，菟丝子可调节调节性T细胞(Treg)/辅助性T细胞17(Th17)，促使Treg /Th17向Treg偏移，重建免疫内环境稳态，桑寄生水提物可抑制急性炎性反应[23-24]。由此可见，在重组人粒细胞刺激因子皮下注射治疗基础上增加补肾活血方可更有效抑制炎性反应，改善患者免疫状态。本研究中观察组对母体免疫状态改善和炎性反应控制效果优于对照组，且2组患者均未出现严重不良反应，说明重组人粒细胞刺激因子皮下注射联合补肾活血方治疗安全性高，体现了中医药毒副作用少的优势。

综上，重组人粒细胞刺激因子皮下注射联合补肾活血方可更有效地提高T淋巴细胞亚群及NK细胞免疫功能，抑制炎性反应，改善临床症状，提高疗效，值得在临床推广。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

谢春红、梁松岳：课题设计，设计研究方案，实施研究过程和论文撰写；钱平：提出研究思路，论文审核;彭艳丽、谢锂岑：资料搜集整理，进行统计学分析和修改