人类白细胞抗原组织配型基因分型国家参考品的研制

胡泽斌，高飞，刘湘，兰更欣，李丽莉，黄杰

1.中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所非传染病诊断试剂室，北京100050 2.北京博奥晶典生物技术有限公司，北京101111

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因位于6 号染色体短臂上6p21.3，全长约3 600 bp，由200 多个基因座位组成，是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体［1-2］。HLA 在抗原识别、提呈、免疫应答及调控方面发挥重要作用，是导致移植排斥的主要抗原，也被称为移植抗原［3］，因此，造血干细胞及器官移植均需在移植前进行HLA 配型［4］。

随着测序技术的发展，基于DNA 序列的分型方法基本取代了传统的血清学及细胞学分型方法［5-6］，主要包括低中分辨序列特异性引物方法（PCR sequence specific primer，PCR-SSP）、中分辨序列特异性寡核苷酸探针方法（polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probes，PCR-SSO）、高分辨基因测序分型方法（sequence-based typing，PCR-SBT）及近年迅速发展的二代高通量测序方法（next generation sequencing，NGS）［7-8］，其中 PCR-SBT 法是 WHO 推荐的HLA 分型方法的金标准。目前，已有多家企业的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1 基因分型检测试剂盒获批上市，同时还有许多企业正在申报此类试剂盒注册。我国目前尚无针对HLA 组织配型基因分型检测相关试剂盒的国家参考品，无法对该类试剂盒进行统一的质量评估，为确保其临床测定结果准确可靠，本实验研制一套涵盖中国人群常见HLA 位点型别信息的HLA 组织配型基因分型国家参考品，以期为临床细胞组织器官移植配型提供保障。

1 材料与方法

1.1 样本 采集45 名志愿者（均已签署知情同意书）5 ～ 10 mL 外周血，置无菌肝素锂抗凝采血管中，2 ～ 8 ℃保存。志愿者外周血基因组DNA 的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1 等 5 个位点的高分辨基因分型信息预先采用金标准PCR-SBT 法获得。

1.2 病毒 EB 病毒液由深圳华大智造科技有限公司提供。

1.3 主要试剂及仪器 人外周血淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；基因组DNA 提取试剂盒（磁珠法）及Qubit Fluorometer 3.0 购自深圳华大智造科技有限公司；HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLADRB1、HLA-DQB1 位点基因高分辨分型试剂盒（测序法）购自北京博奥晶典生物技术有限公司；Nano-Dorp 分光光度计购自美国安捷伦公司。

1.4 永生化淋巴细胞系的建立 45 份外周血样本中加入人淋巴细胞分离液，300×g离心30 min，获得单个核淋巴细胞；加入1.5 mL EB 病毒液，按文献［9-10］的方法进行细胞转化及细胞培养。显微镜下观察细胞由单个逐渐成团状聚集，生长旺盛，则表明永生化细胞系建立成功。

1.5 国家参考品的制备及验证 采用基因组DNA提取试剂盒（磁珠法）提取建立成功的永生化细胞系的基因组DNA，通过分光光度计测定A260／280。将基因组DNA 反复冻融3 次，取冻融前及冻融后的基因组DNA 样本，进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。通过 Qubit Fluorometer 3.0 精确定量各样本的DNA 浓度，将各样本稀释至 20 ng ／ μL，经 HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1 位点基因高分辨分型试剂盒（测序法）对冻融前样品进行全外显子基因分型，并与预先采用金标准SBT 法获得的高分辨基因分型信息进行比较。将检测结果符合要求的样本组成一套国家参考品。

1.6 国家参考品的稳定性及均匀性验证 随机取3 套参考品在-20 ℃与室温（20 ～ 25 ℃）之间反复冻融3 次（每隔1 d 冻融1 次），将冻融前后的基因组DNA 样本按 1.4 项方法进行A260／280测定、DNA 定量和琼脂糖凝胶电泳分析，并采用PCR-SBT 法进行分型验证。

2 结 果

2.1 永生化淋巴细胞系的建立 45 份外周血样本分离的单个核淋巴细胞经EB 病毒转化后，培养5 ～7 d，镜下可见少量聚集的细胞团；培养10 ～14 d 可见细胞团变大变多，细胞生长旺盛，表明细胞已成功转化为淋巴母细胞样B 细胞。见图1。最终获得38株永生化HLA 细胞系，编号为1 ～38。

图1 细胞生长情况的镜下观察（× 100）Fig.1 Microscopy of cell growth（× 100）

2.2 国家参考品的制备及验证 经1%琼脂糖凝胶电泳分析，冻融前和冻融3 次后的DNA 样品均未见拖带或弥散带，条带完整清晰，符合实验室对基因组DNA 完整性的要求，见图2。DNA 样品的A260／280均在1.80 ～2.15 之间，表明DNA 的纯度较高，满足检测要求，且每份样本2 条染色体的分型结果均与建系前外周血基因组DNA 的分型信息一致，见表1。将 38 份样本按 30 μL 进行分装，浓度为 20 ng ／ μL，组成一套HLA-组织配型国家参考品盘。

图2 冻融前后DNA 样本的完整性检测Fig.2 Integrity of DNA samples before and after freeze-thawing

表1 基因组DNA 样本的纯度及分型结果Tab.1 Purity and typing of genomic DNA samples

2.3 国家参考品的稳定性及均匀性验证 3 套国家参考品的A260／280在 1.80 ～ 2.15 之间，表明 DNA 纯度不受影响；DNA 浓度为（20.0 ± 0.5）ng ／ μL，表明DNA 稳定未降解；经SBT 法验证，3 套国家参考品冻融前后样本的 HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 基因的高分辨分型结果一致，且与2.2 项分型结果相符。表明本实验室研制的HLA 组织配型基因分型国家参考品稳定性和均匀性良好。

3 讨 论

HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1 基因与组织器官移植密切相关，移植的供受体双方HLA配型程度越高，移植成功率和受体长期存活率越高［11-12］，因此HLA 基因分型试剂盒的质量关乎临床检测的准确性，直接影响移植配型成功率和受体存活率，标准物质是确保和提升试剂质量的重要手段之一［13-14］。

足量原料的持续供应是制约标准物质发展的瓶颈之一，尤其是大量多人份的临床血液样本。本研究采用永生化建系的手段解决该困难，充分确保了国家参考品的持续供应及换批连续性。永生化建系仅需抽取志愿者外周血3 ～5 mL，操作简便，永生化建立也是HLA 国际质控盘通常采用的技术手段。因此，HLA 组织配型基因分型国家参考品与国际质控盘（UCLA，IHWG）技术水平相当，本研究建立的HLA基因中国人群实物参考盘为国际间的交流合作提供了支撑。本研究结果表明，永生化淋巴细胞系基因组HLA 的检测结果与临床血液样本DNA 的HLA 分型结果一致，该永生化淋巴细胞系的遗传信息稳定，可作为国家参考品的遗传资源。

HLA 组织配型基因分型参考品为首批研制的定性基因分型参考品，参考品原料系人全血转化的永生化细胞系，参考品性质为DNA 样本，DNA 样本自身的均匀性和稳定性良好［15-16］，常规在-20 ℃以下保存，且要求干冰或-20 ℃冷链运输，用户不宜反复冻融后使用。本研究将38 份DNA 样本反复冻融3 次后，DNA 样品的A260／280在 1.80 ～ 2.15 之间，分型结果均与PCR-SBT 法检测结果一致，表明建立HLA组织配型基因分型国家参考品的量值准确性、均一性和稳定性均符合要求，可用于HLA 组织配型类核酸检测试剂盒的质量控制和评价。