人β2 微球蛋白在不同原核表达载体中的表达及活性比较

陈宴霞，黄曼娜，邱立明，刘曼，蔺庆辉

青岛中科爱博生物科技有限公司，山东青岛266400

β2-微球蛋白（β2-microglobμlin，β2MG）作为肾功能标志物是早期诊断肾病的一项重要生化指标［1-3］，在正常情况下，由于其体积小，通常在肾小球易过滤，并被肾脏的近端肾小管细胞分解代谢［4-5］，若肾功能受损，则血清中β2MG 就会升高。近年来，β2MG又作为多种肿瘤标志物备受众多学者关注，由于恶性肿瘤细胞具有超强合成β2MG 的能力，在临床上如肾癌、肺癌、乳腺癌、消化系统等恶性肿瘤患者血清中β2MG 含量超过正常范围，已作为联合检测指标广泛应用于肿瘤诊断和监测［5-8］。因此，临床关于β2MG 的血清学检测指标对于疾病诊断具有重要意义，值得大力推广应用。

β2MG 为一种低相对分子质量蛋白，是由99 个氨基酸组成的单链多肽，在第25 和80 位半胱氨酸有1 个链内二硫键，相对分子质量大小为11 800，与免疫球蛋白具有序列同源性，特别是与IgG 分子的CH3 结构域具有同源性［9］。鉴于其重要的临床应用价值，本研究旨在通过基因工程技术，利用两种原核表达载体重组表达人β2MG，并分别对获得的融合蛋白进行活性检测，为后续免疫原的筛选及制备相应的单克隆抗体创造条件，并为相关临床诊断试剂盒的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒及菌株 原核表达载体pET-28a（+）（5 369 bp，His-tag）和 pET-32a（+）（5 900 bp，Trx-Histags）由马来西亚Novagen 公司提供；E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）感受态细胞购自日本TaKaRa 公司。

1.2 主要试剂及仪器 质粒小量提取试剂盒为德国Qiagen 公司产品；核酸回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；限制性内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ为宝生物工程（大连）有限公司产品；T4 DNA 连接酶购自德国Promage 公司；HRP 标记的兔抗羊IgG（检测抗体）、TMB 显色液和BSA 均购自北京索莱宝有限公司；羊源β2MG 多克隆抗体（捕获抗体）购自深圳市菲鹏生物股份有限公司；Ni-NTA 树脂为美国通用电气（GE）公司产品。

1.3 不同表达载体重组质粒的构建 通过NCBI 网站下载 β2MG基因序列（NM_004048.4），去除信号肽，根据大肠埃希菌的优势密码子进行基因优化，使其利于在大肠埃希菌中表达。由于所选表达载体的5′端均有His 标签，在基因3′端分别加入了终止子，避免过多不必要的末端表达，在优化后基因序列两端加入酶切位点（EcoRⅠ／ HindⅢ），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。将合成序列进行酶切回收后，分别连接至 pET-28a（+）和 pET-32a（+）表达载体，构建重组质粒 pET-28a（+）-β2MG和 pET-32a（+）-β2MG，转化入感受态E.coliDH5α 中，分别进行 Kana（50 μg ／ mL）和 Amp（100 μg ／ mL）抗性 LB平板筛选培养，挑取阳性单克隆菌株，进行PCR 鉴定，阳性菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，并进行序列比对确认。

1.4 重组表达菌株的构建及目的基因的诱导表达 将测序正确的重组质粒转化入感受态E.coliBL21（DE3）中，分别进行 Kana（50 μg ／mL）和 Amp（100 μg ／ mL）抗性LB 平板培养过夜，挑取长势较好的单克隆菌株于LB 液体培养基中培养，待菌液浓度（A600）达0.5 时，加入 IPTG（0.4 mmol ／L），分别于 25 及 37 ℃梯度诱导表达过夜。取1 mL 各菌液，10 000×g离心1 min，收集菌体，加入 600 μL 蛋白缓冲液（25 mmol／ L Tris-HCl，pH 8.5）重悬，于冰上利用超声波破碎仪超声破碎处理5 min（超声3 s，关闭3 s，功率10 W），离心后分别取上清和沉淀，进行15% SDS-PAGE 分析，确定β2MG 在不同表达载体中表达的最佳诱导条件，其中pET-28a（+）载体的重组蛋白于37 ℃表达形式为 His-β2MG（相对分子质量 15 000），pET-32a（+）载体的重组蛋白于25 ℃表达形式为Trx-Hisβ2MG（相对分子质量30 000）。

1.5 重组β2MG 蛋白的扩大培养及纯化 取5 mL 菌液，接种于500 mL LB 液体培养基中扩大培养，按照最佳诱导温度诱导表达过夜，4 500 ×g离心15 min，收集菌体，加入蛋白缓冲液（25 mmol ／ L Tris-HCl，pH 8.5）重悬，6 000 ×g离心 20 min，弃上清，加入蛋白缓冲液，超声破碎处理30 min（超声3 s，间隔5 s，功率 10 W），10 000 ×g离心 15 min，收集纯上清表达菌株的上清液作为蛋白原液，直接过Ni 柱进行亲和纯化；若包涵体表达则收集沉淀部分，经洗涤、尿素溶解后作为蛋白原液，进行Ni 柱亲和纯化。收集各梯度蛋白洗脱液，分别取10 μL，经15%SDS-PAGE分析蛋白纯度，合并主峰蛋白液进行透析复性。

1.6 两种重组β2MG 蛋白活性的比较 采用间接ELISA 法。利用紫外分光光度法于nanodrop 仪测定蛋白浓度，加入酶标板（浓度为 25 μg ／ mL），4 ℃包被过夜；依次加入倍比稀释的羊源β2MG 多克隆抗体及 HRP 标记的兔抗羊 IgG（1 ∶10 000 稀释）作为一抗和二抗，37 ℃孵育1 h，使抗原抗体充分识别；加入100 μL TMB 显色液显色10 min；加入1% H2SO4溶液终止反应。于酶标仪波长450 nm 处读取吸光度值，比较不同载体表达的重组β2MG 蛋白之间的活性差异。

2 结 果

2.1 不同表达载体重组质粒的鉴定 重组表达质粒pET-28a（+）-β2MG和 pET-32a（+）-β2MG经 2%琼脂糖凝胶电泳分析，分别可见5 666、6 197 bp 的重组质粒片段，大小与预期相符；两种重组质粒β2MG基因的PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，可见297 bp 的特异性片段，大小与预期相符。见图1。测序结果经比对显示，插入片段的基因序列与预期一致，未发生突变。

图1 重组表达质粒的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoretic profile of recombinant plasmids

2.2 重组表达菌株的鉴定 15% SDS-PAGE 分析显示，6 株 pET-28a（+）-β2MG／ BL21（DE3）重组菌在相对分子质量约15 000 处有明显的蛋白表达条带，6株 pET-32a（+）-β2MG／ BL21（DE3）重组菌在相对分子质量约30 000 处有明显的蛋白表达条带，大小均与理论值相符，见图2。

图2 重组表达菌株的鉴定Fig.2 Identification of recombinant bacterial strains

2.3 重组β2MG 蛋白的表达形式 15% SDS-PAGE分析显示，两种载体所表达的目的蛋白量相当，约占总蛋白的 65%。pET-32a（+）-β2MG／ BL21（DE3）于37 ℃诱导的上清和沉淀均有目的蛋白表达，而25 ℃诱导可实现全部上清表达；pET-28a（+）-β2MG／BL21（DE3）表达的目的蛋白无论低温或高温诱导均以包涵体形式存在。见图3。表明不同表达载体所表达的β2MG 溶解性不同。

图3 重组β2MG 蛋白表达形式的SDS-PAGE 分析Fig.3 Analysis of form of recombinant β2MG protein by SDS-PAGE

2.4 纯化蛋白的鉴定 15% SDS-PAGE 分析显示，纯化的重组β2MG 蛋白在相对分子质量约15 000和 30 000 处分别可见 His-β2MG 和 Trx-His-β2MG特异性条带，纯度可达95%以上，见图4。蛋白浓度约 3 mg ／ mL。

图4 纯化重组β2MG 蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of purified β2MG protein

2.5 两种重组β2MG 蛋白的活性比较 间接ELISA法检测结果显示，随着检测抗体浓度的升高，抗原抗体反应性整体呈上升趋势。与市售对标β2MG 相比，在相同检测抗体浓度下，自制重组蛋白His-β2MG与检测用羊源β2MG 多克隆抗体的免疫学反应性能略差，而自制重组蛋白Trx-His-β2MG 与检测抗体的免疫学反应性优于对标β2MG。见图5。表明不同表达载体对β2MG 的活性影响较明显。

图5 ELISA 法检测两种重组β2MG 蛋白的活性Fig.5 ELISA of activities of two recombinant β2MG proteins

3 讨 论

本研究应用基因重组技术将β2MG基因与不同载体连接，构建重组表达菌株，成功表达了Hisβ2MG 和 Trx-His-β2MG 两种重组蛋白，其中 Trx-Hisβ2MG 降低诱导温度可实现完全可溶性表达，表明低温诱导对获得可溶性表达具有促进作用，这可能是由于降低温度可放慢细胞内蛋白表达速率，分子聚集通常是由于高温下蛋白表达太快来不及正确折叠而形成，可见低温诱导是减小细胞内重组蛋白聚集的一个好方法［10］。通过分析两种蛋白在E.coliBL21（DE3）中的不同表达形式发现，β2MG 在相同的宿主细胞中表达形式不同与表达载体相关，这可能是由于不同表达载体中所含的N-端标签不同造成的，pET-32a（+）载体在 N-端含有增溶标签 Trx，该标签能促进二硫键正确配对，帮助蛋白进行正确折叠［11］，有资料显示，Trx 作为增溶标签有利于蛋白的可溶性表达［12-13］。包涵体通常是由于蛋白瞬间表达量较高、蛋白错误折叠以及二硫键不能正确配对所导致，对于包涵体的一般处理方法是先变性，再通过合适的复性液进行透析复性，过程繁琐，且得到的蛋白活性不一定完整，因此，蛋白的包涵体表达在一定程度上限制了其生物学活性［14-16］，这也合理解释了Trx-Hisβ2MG 的免疫学活性明显高于His-β2MG。

综上所述，本研究利用两种原核表达载体表达了重组人β2MG，表达的两种融合蛋白活性相差明显，且 Trx-His-β2MG 优于对标 β2MG，不同载体对β2MG 的活性影响较大，表明选择合适的表达载体是β2MG基因在大肠埃希菌中有效表达的一个重要影响因素［17］。本研究为进一步开展相关体外诊断试剂的研发及应用奠定了基础。