熄风定喘方对寒哮型哮喘模型豚鼠气道炎症的影响*

陈梦瑶，尚莉丽

1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031

支气管哮喘（以下简称“哮喘”）是小儿常见的以慢性气道炎症为特征的异质性疾病［1］，其发病机制主要是Th1／Th2细胞因子失衡［2］，主要采用支气管舒张剂联合糖皮质激素雾化吸入治疗，虽然起效快，症状缓解迅速，但存在复发率高、不良反应等不足［3］。Meta分析显示，中医药在防治哮喘方面具有一定优势［4］。本课题所研究的熄风定喘方，是尚莉丽教授的自拟方，以小青龙汤为主方，佐以全蝎、僵蚕、地龙等熄风止痉的虫类中药组成。针对哮喘，大多数学者认为小青龙汤的治疗作用集中表现为抑制炎症反应以平喘［5-7］，熄风止痉类中药有解肌平喘的功效［8］。前期临床研究显示，以小青龙汤为主方的咳喘平颗粒可通过下调抑炎因子、上调促炎因子而控制炎症反应以发挥治疗作用，但加用熄风止痉类中药后作用机制不清楚。血清肥大细胞羧肽酶（mast cell carboxypetidase，MC-CP）、免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）是Th2细胞因子（抑炎因子）的代表，γ-干扰素（interferonγ，IFN-γ）是Th1细胞因子（促炎因子）的代表，其在哮喘发病机制中研究较少［9］。因此，本研究主要探讨熄风定喘方对寒哮型哮喘模型豚鼠气道炎症的影响，以其为临床提供基础。

1 材料

1.1 动物普通级雄性豚鼠72只，3～4周龄，体质量（165±15）g，由南京市浦口区菜芙养殖场提供，苏州大学技术与环境研究所质检，合格证号SCXX（苏）2019-0005。动物饲养于安徽中医药大学（梅山路校区）实验动物中心，自然采光，室内温度（23±2）℃，相对湿度50%～70%，饲养环境安静通风。本实验符合安徽中医药大学实验动物伦理委员会的相关规定和要求，伦理批号：AHUCMguinea pigs2020007。

1.2 药物与试剂熄风定喘方（炙麻黄5 g，炒白芍10 g，细辛3 g，炙甘草3 g，干姜3 g，桂枝6 g，醋五味子6 g，姜半夏10 g，炒杏仁10 g，全蝎3 g，僵蚕10 g，地龙10 g，以上均为单味颗粒剂，由安徽中医药大学第一附属医院提供）；地塞米松片（上海上药信宜药厂有限公司，批号：2980605）。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美国Sigma公司，批号：A5253）；氢氧化铝Al（OH）3佐剂（天津市凯通化学试剂有限公司，批号：HG3185782）；氨基甲酸乙酯（美国Aladdin公司，批号：U108629）；生理盐水（上海第一生化药业公司，批号：060210）；MC-CP试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司，批号：20201109）；IFNγ、IgE试剂盒（武汉基因美科技有限公司，批号：GR2021-01、GR2021-01）。

1.3 仪器酶标仪（雷杜，型号：RT-6000）；离心机（安徽嘉文，型号：JW3021HR）；漩涡混合器（其林贝尔仪器制造公司，型号：GL-88B）；电热恒温箱（上海三发，型号：DNP-9052BS-Ⅲ）。

2 方法

2.1 模型复制将72只豚鼠随机选择12只为正常组，其余豚鼠分别于第8天和第15天腹腔注射1 mL致敏液（100μg OVA＋1 mg Al（OH）3）致敏，第22天开始用1%OVA雾化激发，每次30 min，结束后给予寒冷刺激1 h，连续雾化7 d，从而激发豚鼠哮喘；正常组用生理盐水替代致敏和雾化，其余操作相同。

2.2 动物分组与给药待豚鼠出现张口呼吸伴喘息、频率加快、腹部翕动、躁动不安、搔抓颜面皮毛、咳嗽时发毛竖立，易激惹等现象说明成功引发豚鼠哮喘，引喘成功后，将模型随机分为模型组、熄风定喘方低剂量组（5.68 g·kg-1）、熄风定喘方中剂量组（11.36 g·kg-1）、熄风定喘方高剂量组（22.72 g·kg-1）和地塞米松组（5 mg·kg-1），每组各12只豚鼠，各组给予相应的药物21 d。

2.3 观察豚鼠的一般行为学观察各组大鼠体质量、神态、饮食、呼吸、紫绀、毛色等情况进并进行记录。

2.4 检测血清相关指标末次给药后的2 h后，以20%乌拉坦（1.5 g·kg-1）腹腔注射豚鼠，辅助动脉取血后，检测血清中的MC-CP、IgE、IFN-γ水平。

2.5 HE染色观察肺组织病理形态变化取血后剖胸，取右肺上叶组织置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定，并按照HE染色的步骤进行切片的制备，在显微镜下观察气道炎性细胞浸润情况、肺泡及支气管结构、气道上皮损伤等病理形态改变。

2.6 统计学方法采用SPSS 23.0软件进行统计分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，先正态检验，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，组间两两比较采用LSD检验，若方差不齐，组间比较采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组豚鼠的一般情况正常组豚鼠皮毛光泽、活动自如、反应灵敏、呼吸平稳、毛色光洁、饮食正常；模型组豚鼠出现呼吸加快、张口喘息、口唇发绀、腹部翕动、四肢瘫软、烦躁不安、搔抓颜面皮毛、咳嗽时毛发竖立、被毛逆乱、易激惹等现象，且皮毛干枯、稀疏，饮水量增多，活动频率与食欲减少，反应迟钝，身材瘦削，体重减轻；熄风定喘方低、中、高剂量组与地塞米松组豚鼠亦出现喘息，但症状较轻，且时而躁动、激惹征等表现较模型组不明显，被毛顺滑、颜面皮毛润泽、行动灵活、食欲较模型组有改善。

3.2 各组豚鼠血清中MC－CP、IgE、IFN－γ结果比较与正常组比较，模型组豚鼠血清中MC-CP、IgE水平极显著升高（P＜0.01），IFN-γ水平极显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，熄风定喘方低、中、高剂量组及地塞米松组豚鼠血清中MC-CP、IgE水平显著降低（P＜0.05），IFN-γ水平显著升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组豚鼠血清中MC－CP、IgE、IFN－γ水平比较（±s）

表1 各组豚鼠血清中MC－CP、IgE、IFN－γ水平比较（±s）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05

组别 n 剂量 MC-CP LgE IFNγ正常组12 - 2.04±0.29 2.82±0.19 66.78±5.69模型组 12 - 10.75±0.71＃＃ 12.88±1.12＃＃ 14.45±3.90＃＃熄风定喘方低剂量组 12 5.68 g·kg-1 7.48±0.90* 6.37±0.45* 20.87±1.98*熄风定喘方中剂量组 12 11.36 g·kg-1 6.77±0.99* 5.25±0.66* 29.41±3.40*熄风定喘方高剂量组 12 22.72 g·kg-1 3.99±0.74* 3.99±0.43* 31.87±5.06*地塞米松组 12 5 mg·kg-1 4.32±0.64* 4.17±0.32* 22.39±3.54*

3.3 各组豚鼠肺组织病理结果正常组豚鼠肺组织结构正常，组织内未见水肿部位，气管黏膜上皮完整，管腔内光滑平整无黏液、无狭窄及炎症细胞浸润；模型组豚鼠病变部位见明显水肿，管腔狭窄，黏液细胞不规则增生，可见黏液栓，上皮细胞坏死脱落，管壁有大量炎性细胞浸润，基底膜厚度明显增加；地塞米松组豚鼠肺组织黏膜仍有充血水肿和炎细胞浸润，但较模型组明显减轻，病变处只见少量炎细胞浸润，管腔宽度较模型组明显扩大且无明显黏液栓形成，上皮结构也较完整；熄风定喘方低剂量组豚鼠肺组织管腔狭窄、管壁炎性细胞浸润等程度亦有所降低；熄风定喘方中剂量组的管腔缩小，壁内见少许炎性细胞；熄风定喘方高剂量组豚鼠肺组织管腔扩大，壁内无明显炎性细胞浸润。见图1。

图1 各组豚鼠肺组织病理形态观察（HE染色，×400）

4 讨论

哮喘是小儿常见的一种变态反应性疾病，其发病机制主要表现为气道炎症、免疫与变态反应、气道神经调节和遗传等方面，主要以嗜酸性粒细胞和肥大细胞为主，包括T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等多种细胞组分参与［10］。研究发现，哮喘重要的发生机制是T细胞（Th1／Th2）的免疫调节失衡，表现为Th2细胞因子功能相对激发，Th1细胞因子功能相对受抑制［11］。Th1细胞因子分泌的减少和Th2细胞因子分泌的增加，均直接或间接增加IgE的合成，诱导肥大细胞和嗜酸性粒细胞脱颗粒，发生气道炎症反应［12］。其中肥大细胞分泌出一种重要的炎症介质——MC-CP［13-14］，约占肥大细胞蛋白总量的12%，对肥大细胞分化起重要作用。当哮喘患儿接触致敏原后，机体出现IgE桥联，引发肥大细胞内一系列信号转导［15］。研究表明，在严重的急性变态反应发生过程中，患儿血液或体液中会存在大量肥大细胞释放的活化脱颗粒，致使MC-CP水平在血液及体液中急剧升高而加剧炎症反应［16］。哮喘急性发作患者血液中MC-CP水平与IgE呈正相关［9］。作为Th1细胞因子的代表IFN-γ，其原名为巨噬细胞活化因子，可以调节哮喘小鼠Th1／Th2平衡，抑制杯状细胞增生，减轻呼吸道阻力［17］。IFN-γ不仅能促进Th0向Th1细胞分化，增强自然杀伤细胞免疫应答，还可以抑制Th2细胞表型的分化和功能，加强巨噬细胞的活化补体等，对免疫调节系统具有重要作用，有助于对细胞内病原体进行清除［18］。研究发现，IFN-γ能抑制Th2细胞分泌的白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4），进而抑制IgE的合成，减轻气道的慢性炎症，避免患者哮喘的进一步发展［19-20］。

支气管哮喘属于中医“哮病”的范畴，《证治汇补》阐述其病机责之于胸中气之壅塞，膈间又有顽痰之胶着，再有外寒之侵袭，导致气道不畅，发为哮喘［21］。哮喘发作的内在病因合为“伏风”与“痰饮”［22］，即常因感受外邪或接触异物而诱导伏风发动，即外风引动内风则哮喘发作。哮病有寒热之分，冷哮最为常见。全身或局部应用糖皮质激素是治疗哮喘的首选，但长期应用会出现激素依赖性和抑制免疫细胞，从而加重或诱发感染等不良反应。中医治疗可以调控患者自身的免疫机制，改善患者的气道反应以及细胞、介质等水平，改善临床症状［23］。哮喘发作期，外风引动内风，来势汹汹，喘息明显，肺失宣肃，即急则治其标，结合历代医家观点冷哮型哮喘宜温化或宣散，尚莉丽教授认为辅以熄风止痉药物，更以祛毒平喘。本研究中的熄风定喘方是尚莉丽教授的经验方，以小青龙汤为基础加减化裁而成，组方为炙麻黄、炒白芍、细辛、干姜、炙甘草、桂枝、醋五味子、姜半夏、炒杏仁、全蝎、僵蚕、地龙。熄风定喘方在辨寒热的基础上，重用全蝎、僵蚕、地龙等虫类药，正如叶天士所言：“初为气结在经，久则血伤入络，辄仗蠕动之物松透病根”［24］。此类中药因其性擅走窜、无所不至，故可深入肺络搜邪、祛除内风与毒邪，最终使肺气宣降得宜、内风得息、气道挛急得以缓解。

小青龙汤作为熄风定喘方的基础方，临床主治外寒内饮，具有抗感染、平喘、抗过敏等作用，能够改善肺部通气状况、干预气道重塑［25］。研究发现，小青龙汤不仅可以抑制IgE的生成，拮抗气道变应性炎症［26］，还可抑制气道重塑、降低气道反应性［11］等，以改善支气管哮喘患者咳嗽、喘息、咯痰等临床症状。配伍的全蝎、僵蚕、地龙等虫类药有减轻呼吸道炎症，缓解支气管痉挛等作用［27］。其中僵蚕能够减少IL-4水平，调节Th1／Th2平衡控制气道炎症；全蝎具有免疫抑制、改善慢性气道炎症，实现气道重构；地龙具有舒缓气道平滑肌痉挛，有效扩张支气管的作用，因此其止咳平喘效果显著［3］。

基于以上研究，本研究复制出适应熄风定喘方组方特点的实验动物模型，选取MC-CP、IgE、IFN-γ为寒性哮喘豚鼠的检测指标，并结合豚鼠肺组织病理，更准确地揭示熄风定喘方治疗哮喘的药效。本研究结果发现，与模型组比较，熄风定喘方组豚鼠的行为学有改善；豚鼠血清MC-CP、IgE水平显著降低，IFN-γ水平显著升高，病理结果显示豚鼠肺组织炎症浸润减轻。提示熄风定喘方可能通过降低哮喘豚鼠MC-CP、Ig-E水平、升高IFN-γ水平，改善肺功能以防治哮喘气道炎症。