景芪愈溃胶囊对脾胃虚寒型胃溃疡大鼠的作用及其机制*

范珉珏， 段永强， 虎峻瑞， 罗 强， 杨晓轶， 李能莲， 马 骏， 巩子汉

（甘肃中医药大学1基础医学院，2敦煌医学与转化教育部重点实验室，3中医方药挖掘与创新转化重点实验室，甘肃兰州 730000；4中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700）

胃溃疡（gastric ulcer）是发生于贲门与幽门之间的消化性溃疡，与炎症关系密切［1］。目前西医治疗以抑酸类药物、胃黏膜保护剂及抗菌治疗为主，注重胃溃疡病理层面的修复，而中医治疗则根据患者胃部疼痛的特点及伴随症状进行辨证论治［2］，在促进胃溃疡愈合的同时，减轻患者伴随症状，提高患者生活质量。脾胃虚寒为最常见的证型之一［3］，表现为胃脘部隐痛，喜温喜按，得食痛减，并伴有四肢疲倦、畏寒肢冷、大便溏薄等症状，舌淡或舌边齿痕，舌苔薄白，脉虚弱或迟缓。张仲景《金匮要略》的甘温建中理论可有效地指导治疗脾胃虚寒型胃溃疡［4］。景芪愈溃胶囊（Jingqi-Yukui capsule，JQYK）为甘肃中医药大学附属医院院内制剂，发掘于敦煌古医方大阳旦汤，以甘温的黄芪和饴糖为君药，行温中益气健脾之效。前期研究发现，JQYK 可有效提高胃内前列腺素E2及血中表皮生长因子的含量，促进胃溃疡愈合［5］。在此基础上，本研究拟通过动物实验，观察JQYK 对脾胃虚寒型胃溃疡大鼠胃组织中血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）和细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表达水平及促炎因子［白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）和IL-6］和抗抑炎因子（IL-4 和IL-13）含量的影响，探讨该复方对脾胃虚寒型胃溃疡的疗效及作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 动物 SPF 级Wistar 大鼠70 只，雌雄各半，体重（200±20）g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，许可证号为SCXK（甘）2015-0002，合格证号为62001000000449。本实验获得甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号为2019001。

1.2 主要药物 JQYK（甘肃中医药大学附属医院，每粒0.4 g），成人口服剂量为4.5 g/d，批号181101；雷贝拉唑钠肠溶胶囊（rabeprazole sodium entericcoated capsule，RBPZ）购自济川药业集团有限公司（每粒10 mg），成人口服剂量为20 mg/d，批号1807015；安胃疡胶囊（An-Weiyang capsule，AWY）购自惠州市九惠制药股份有限公司（黄酮类化合物每粒0.2 g），成人口服剂量为1.6 g/d，批号181014。

1.3 试剂和仪器 冰乙酸（批号20170327，天津市富宇精细化工有限公司）；大鼠IL-1、IL-4、IL-6 和IL-13 ELISA 试剂盒（上海将来实业股份有限公司）；Trizol试剂（批号152104；Ambion）；反转录试剂盒（批号AI40704A）和RT-qPCR试剂盒（批号AI61180A）均购自TaKaRa；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体（批号RS23710）和抗GAPDH 抗体（批号YM3215）均购自ImmunoWay；抗VCAM-1 抗体（批号GTX12133）和抗ICAM-1 抗体（批号GTX22213）均购自GeneTex。

BX51-32H01 显微镜（Olympus）；DF110 电子分析天平（江苏常熟衡器工业有限公司）；SCIENTZ-48高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；CT14RD高速低温离心机（上海天美科学仪器有限公司）；HH-4 数显恒温水浴箱（江苏省金坛市友联仪器研究所）；BIOMATE 3S 核酸蛋白测定仪、10705 Benchmark Plus 酶联免疫检测仪、CFX96 Optics Module PCR 仪、S1000逆转录仪、ChemiDoc XRS 凝胶成像分析系统和PowerPac WB 电泳及转印系统（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 实验分组、造模及动物给药 除空白（blank）组（n=8，雌雄各半）大鼠正常饲养不予造模外，其余大鼠（n=62）造模参照文献［6-7］方法：（1）大黄苦寒泻下法：4 ℃的100%大黄水煎液，20 mL/kg，每日灌胃1次。（2）饥饱失常喂养法：单日禁食，双日足量喂养，连续造模10 d。大鼠扎堆抱团，精神萎靡、眯眼，皮毛枯槁杂乱无光泽，脱毛明显，便稀或便溏，体重增长缓慢，摄食量减少（适应造模药物后，每日摄食量维持在每只19 g 左右），肛温降低，评定脾胃虚寒模型建立成功。（3）改良Okabe 法：禁食24 h，予10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，剑突下0.5 cm纵向切开腹壁，将胃移出腹腔，用内径5 mm 的玻璃管垂直置于胃前壁体窦交界处靠胃窦侧浆膜面，管内加入冰乙酸0.2 mL，1 min 后用棉签蘸出冰乙酸，然后将胃放回腹腔，大网膜覆盖，逐层缝合，温覆保暖待醒。手术3 d 后，随机处死造模大鼠3 只，观察胃溃疡形成情况，包括胃溃疡的大小，黏膜的色泽及瘀血。评价脾胃虚寒型胃溃疡模型大鼠胃溃疡形成后开始治疗，用随机数字表法分为模型（model）组，JQYK 高（JQYK-H）、中（JQYK-M）、低（JQYK-L）剂量组，中药阳性对照（AWY）组，以及西药阳性对照（RBPZ）组，每组8只，分笼饲养。

分组后开始灌胃给药，每日1 次，连续14 d。blank 组和model 组取2 mL 蒸馏水灌胃，其余各干预组按体表面积折算法计算大鼠等效剂量（相当于临床成人用量的5.4 倍），取相应剂量药物胶囊内容物与蒸馏水制成2 mL 混悬液灌胃。JQYK 的高、中、低剂量分别为0.81、0.405 和0.202 g/kg，AWY 的剂量为0.144 g/kg，RBPZ的剂量为1.8 mg/kg。

2.2 取材 末次灌胃给药后禁食不禁水24 h，测体重后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剖腹取胃，沿胃大弯剪开以冰冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干，测量后截取胃窦部组织，一部分置于4%多聚甲醛中固定，其余置于-80 ℃冰箱保存待测；大鼠尸体集中交于科研实验动物中心进行无害化处理。

2.3 溃疡指数（ulcer index，UI）检测 使用游标卡尺测量溃疡最大长径，胃黏膜UI计算公式为：UI=π×（溃疡最大长径/2）²。

2.4 HE染色 取4%多聚甲醛中已固定的胃窦部组织，经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，光镜下观察。

2.5 ELISA法检测胃组织IL-1、IL-4、IL-6和IL-13的含量 制备各组胃组织10%组织匀浆，使用大鼠IL-1、IL-4、IL-6 和IL-13 ELISA 试剂盒，严格按照说明书操作，经过加样、温育、洗涤、加酶标试剂、温育、洗涤、显色、测定等步骤，检测并计算目标蛋白的含量。2.6 RT-qPCR 检测mRNA 表达 采用Trizol 法提取总RNA，用反转录试剂盒合成模板cDNA 并扩增。设计引物序列并由TaKaRa 公司合成，见表1。以βactin 为内参照，相同模板相同基因设3 个复孔、6 次平行实验，得到各扩增反应的Ct值，用2-ΔΔCt法定量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The primer sequences for RT-qPCR

2.7 Western blot 检测蛋白水平 提取各组胃组织总蛋白，BCA 试剂盒测定总蛋白浓度，配制SDSPAGE 凝胶，蛋白取每泳道4 μg 上样，电泳并转膜，5% 牛血清白蛋白封闭，加入Ⅰ抗（抗GAPDH、VCAM-1 和ICAM-1 抗体与封闭液配制比例分别为1∶5 000、1∶2 000 和1∶2 000）4 ℃过夜，次日TBST 洗膜后加入Ⅱ抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 与封闭液配制比例1∶1 0000），室温孵育1 h，TBST 洗涤曝后光显影，用Bio-Rad Quantity One 图像分析软件进行扫描并用ImageJ 图像处理软件进行分析。

3 统计学处理

采用SPSS 24.0软件处理。计量资料用均数±标准差（mean±SD）表示。各组间比较采用单因素方差分析，两两比较用采用SNK-q检验；由于model 组、JQYK-M 组及AWY 组大鼠的UI 数据不满足正态分布，故采用多个独立样本的秩和检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠胃组织的病理学观察

与blank 组比较，model 组大鼠胃部积食严重，生理盐水洗去食物残渣后可见深至肌层的较大糜烂溃疡面，黏膜壁溃疡处凹陷，溃疡周边皱襞消失；100倍镜下观察可见黏膜层、黏膜下层和肌层大面积缺失、坏死，血管和胃底腺基本消失，有大量炎症细胞渗出。与model 组比较，JQYK-H 组大鼠胃黏膜完整光滑，局部颜色稍淡，皱襞清晰，未见溃疡点；100 倍镜下观察可见黏膜单层柱状上皮分布完整均匀，柱状细胞间分界清楚，排列较整齐，黏膜固有层、黏膜肌层、黏膜下层和肌层结构清晰完整，可见少量炎症细胞渗出，但与blank组最为接近。见图1。

Figure 1. HE staining results of the gastric tissue in rats（×10）. RBPZ：rabeprazole sodium enteric-coated capsule；JQYK-H：highdose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-M：medium-dose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-L：low-dose Jingqi-Yukui capsule；AMY：An-Weiyang capsule.图1 各组大鼠胃组织HE染色结果

2 各组大鼠UI 和胃组织IL-1、IL-6、IL-4 和IL-13蛋白含量的比较

7 个组溃疡指数的平均秩次由高到低依次是：model 组、JQYK-L 组、JQYK-M 组、AWY 组、RBPZ 组、JQYK-H 组和blank 组（P＜0.01，即7 个组的溃疡指数不全相同）。与blank 组比较，model 组大鼠胃组织IL-1 和IL-6 含量显著升高（P＜0.01）；与model 组比较，各干预组大鼠IL-1 和IL-6 含量有不同程度的降低，尤以JQYK-H 组效果显著（P＜0.05）。与blank 组比较，model 组大鼠胃组织IL-4 和IL-13 含量显著降低（P＜0.01）；与model 组比较，各干预组大鼠IL-4 和IL-13 含量有不同程度的升高，尤以JQYK-H 组效果显著，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠UI及胃组织IL-1、IL-6、IL-4和IL-13含量的比较Table 2. Comparison of ulcer index（UI）and levels of IL-1，IL-6，IL-4 and IL-13 in gastric tissue of the rats（Mean±SD. n=8）

3 各组大鼠胃组织VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 和蛋白表达的比较

与blank 组比较，model 组大鼠胃组织VCAM-1和ICAM-1 的mRNA 和蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与model 组 比 较，除JQYK-M 和JOYK-L 组VCAM-1 的mRNA 表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各干预组大鼠胃组织VCAM-1 和ICAM-1 的mRNA 和蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），尤 以JQYK-H 组 效 果 显 著（P＜0.01），见图2、3。

Figure 2. The mRNA expression of VCAM-1 and ICAM-1 in the gastric tissues of different groups detected by RT-qPCR. JQYK-H：high-dose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-M：medium-dose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-L：low-dose Jingqi-Yukui capsule；AMY：An-Weiyang capsule；RBPZ：rabeprazole sodium enteric-coated capsule. Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs blank group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.图2 RT-qPCR检测大鼠胃组织VCAM-1和ICAM-1的mRNA表达水平

Figure 3. The protein expression of VCAM-1 and ICAM-1 in the gastric tissues of different groups determined by Western blot. JQYKH：high-dose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-M：medium-dose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-L：low-dose Jingqi-Yukui capsule；AMY：An-Weiyang capsule；RBPZ：rabeprazole sodium enteric-coated capsule. Mean±SD. n=8. **P＜0.01 vs blank group；##P＜0.01 vs model group.图3 Western blot检测各组大鼠胃组织VCAM-1和ICAM-1的蛋白表达

讨 论

JQYK 以敦煌古医方大阳旦汤加乌贝散为主，方中以生黄芪和饴糖为君药，益气健脾、养血生肌；桂枝、白芍和红参三药同用，发挥温中健脾、通脉止痛之功；海螵蛸和浙贝母同用抑酸敛疮，且浙贝母药性偏寒，使全方不至过于温补；红景天益气通脉活血；白及和三七共奏止血敛疮生肌之功；生姜、大枣和陈皮合而升腾中焦生发之气行津液和营卫；炙甘草缓急止痛、调和诸药。全方具有益气温阳、健脾和胃、敛疮生肌、抑酸止痛之效。

细胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）是指由细胞产生，介导细胞与细胞之间、细胞与基质间相互接触并结合的一类分子，主要包括ICAM-1 和VCAM-1。CAMs 与炎症关系密切［8］。在IL-1、IL-6 和TNF-α 等炎症细胞因子的作用下，ICAM-1 在白细胞和内皮细胞上的表达可迅速上调，与此同时，在体内炎症的病理条件下，VCAM-1也在血管内皮和血管平滑肌细胞上表达［9］；ICAM-1 和VCAM-1 的高表达促进了炎症细胞的渗透，促使炎症持续发生，导致炎症因子IL-1 和IL-6 等的持续产生，形成了炎性通路的循环从而加重胃黏膜的损伤。因此下调粘附分子可抑制炎症细胞渗透［10］，从而抑制炎症反应促进黏膜修复［11］。相关研究发现，降低ICAM-1 和VCAM-1 表达水平可减缓炎症反应而发挥抗胃溃疡的作用［12］；减少IL-1β的分泌，抑制炎症反应可发挥对胃溃疡的治疗作用［13］；降低胃组织匀浆IL-6、IL-8 及TNF-α 的水平可减轻局部炎症细胞浸润，促进胃溃疡愈合［14］。本研究发现，脾胃虚寒型胃溃疡大鼠胃组织中ICAM-1 和VCAM-1 的mRNA 和蛋白表达水平及IL-1和IL-6 含量均显著升高；JQYK 各剂量组大鼠胃组织ICAM-1 和VCAM-1 的mRNA 和蛋白表达水平及IL-1和IL-6含量均有不同程度降低，提示JQYK 可抑制细胞粘附分子VCAM-1 和ICAM-1 的表达进而减少促炎因子IL-1和IL-6的含量，从而发挥抗炎作用。

此外，相关研究指出，炎症因子释放增多，改变机体内稳态，可诱发Th1/Th2 细胞间失去平衡，从而改变胃黏膜的屏障功能和免疫反应导致胃溃疡的产生［15］。IL-4和IL-13都是由活化的Th2细胞分泌的免疫调节细胞因子［16］，可作用于巨噬细胞，使其活化为M2 型巨噬细胞［17］，发挥抗炎作用，促进创面愈合［18］。研究表明，降低IL-6 和TNF-α 含量，升高IL-4 含量可减少胃溃疡面积［19］。本研究表明，脾胃虚寒型胃溃疡大鼠胃组织IL-4 和IL-13 含量显著降低；JQYK 各剂量组大鼠胃组织IL-4 和IL-13 含量不同程度的升高，提示JQYK 可提高抗炎因子IL-4 和IL-13 的含量而发挥抗炎作用。

综上所述，JQYK 可有效降低脾胃虚寒型胃溃疡大鼠的UI，促进胃溃疡的愈合，其机制可能与其抑制VCAM-1和ICAM-1的表达进而调控炎症因子的平衡有关。