右美托咪定通过Akt/mTOR自噬通路介导NLRP3炎症小体失活而减轻脓毒症大鼠肠损伤*

陈 浩， 李慧利， 杜 亮， 周长浩， 陈 欢， 王 欣

（河北医科大学第一医院麻醉手术科，河北石家庄 050031）

脓毒症由感染引发，患者全身发生有害反应，会出现低血压、恶病质和发热等症状，严重影响生命安全，危害严重［1］。脓毒症会导致炎症因子和自由基增多、出现线粒体损伤等，这些情况均导致细胞自噬增多，而自噬在脓毒症中发挥重要调节作用［2］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）自噬通路作为上游通路汇合点，在脓毒症大鼠中对于自噬调控发挥重要作用［3］。脓毒症中激活自噬可以抑制炎症反应，从而减少细胞死亡，减轻患者症状［4］。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）作为α2受体激动药物，对脓毒症患者有保护作用，可降低28 d死亡率和缩短机械通气时间［5］，但作用机制尚需进一步探讨。因此，本研究采用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture，CLP）建立脓毒症大鼠模型，探究DEX 对自噬及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体的作用，以期寻找DEX缓解脓毒症的机制。

材 料 和 方 法

1 动物

50 只SPF 级雄性Wistar 大鼠，10 周龄，体质量（200±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（京）2016-0011。所有大鼠均在温度（23.5±0.5）℃、湿度（50±5）%、12 h黑暗/12 h 光照条件下自由饮水摄食，暂养1 周后进行实验，实验动物符合3R 原则。本研究经河北医科大学第一医院动物伦理审查委员会审核并通过。

2 主要试剂

盐酸DEX注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司；国药准字H20090248；规格：2 mL、200 μg）；PI3K/mTOR 抑制剂NVP-BEZ235（MedChemExpress；规格：200 mg；纯度：99.68%）；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA；Sigma；规格：100 mg）；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；大鼠白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、兔源Ⅰ抗［beclin-1、LC3-II、Akt、磷 酸 化（phosphorylated，p）-Akt、mTOR、p-mTOR、NLRP3、含caspase 募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）及caspase-1 及其前体pro-caspase-1、GAPDH］及Ⅱ抗羊抗兔IgG（Abcam）。光学显微镜（深圳市隆基金相仪器设备有限公司，型号：LJ-JX2030）；透射电镜（Thermo Scientific，型号：Talos）；蛋白凝胶成像仪（北京中西华大科技有限公司，型号：JY02G）。

3 主要方法

3.1 分组及处理 将大鼠分成假手术（sham operation，sham）组、模型（model）组、DEX 组、DEX+NVPBEZ235组和DEX+3-MA组，每组10只。除假手术组外，其余各组参考文献［6］采用CLP建立脓毒症大鼠模型：大鼠术前禁食但不禁水，麻醉大鼠，大鼠仰卧固定在鼠板上，腹腔经消毒后在正中切开约1.5 cm 切口，找出盲肠，结扎回盲瓣及远端盲肠，无菌注射器针头在结扎处与盲肠末端中点处做2 次贯通穿孔，挤出肠内容物，盲肠连同挤出的肠内容物一同回纳腹腔，逐层缝合切口。假手术组大鼠除了不结扎穿孔盲肠外其余处理相同。造模结束后DEX组、DEX+NVP-BEZ235 组和DEX+3-MA 组分别在0、3 和6 h 腹腔 注 射10 μg/kg DEX［7］，DEX+NVP-BEZ235 组 在DEX 组基础上腹腔注射30 mg/kg NVP-BEZ235，DEX+3-MA 组在DEX 组基础上腹腔注射15 mg/kg 自噬抑制剂3-MA。

3.2 样品采集 造模24 h，腹主动脉采血，断头法处死大鼠，收集肠道组织，部分置于4%多聚甲醛中固定、部分置于-80 ℃冰箱保存。

3.3 HE 染色观察肠道组织形态和肉眼观察结肠大体形态 4%多聚甲醛中固定组织，梯度乙醇脱水后进行常规包埋、切片、贴片、烤片，切片（厚度5 μm），切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，晾干后苏木精染色、0.1%盐酸酒精分化、伊红复染，乙醇脱水、二甲苯透明后封片，光学显微镜下观察肠道组织形态。另外，肉眼观察大鼠结肠标本，进行结肠大体形态损伤指数（colon macroscopic damage index，CMDI）评分。评分标准：0 分，无损伤；1 分，轻度水肿、充血，表明光滑、无糜烂；2分，充血、水肿，组织表面呈颗粒状，有糜烂或肠黏连；3分，高度水肿、充血，黏膜表明坏死或溃疡，溃疡最大纵径＜10 mm，肠壁增厚或表面坏死及炎症；4 分，在3 分基础上溃疡最大纵径≥10 mm，或出现全肠壁坏死。

3.4 ELISA 检测血清中IL-1β 和TNF-α 水平 腹主动脉血室温静置2 h，1 400×g离心10 min，上清为血清。参考大鼠IL-1β 和TNF-α ELISA 试剂盒检测血清中IL-1β和TNF-α水平。

3.5 免疫组化检测肠道组织中beclin-1 和LC3-II 蛋白表达情况 3.3 中切片经0.1 mol/L 枸橼酸钠缓冲液高温抗原修复，3% H2O2甲醇溶液封闭抗原，加入beclin-1（1∶100）和LC3-II（1∶250）抗体，4 ℃孵育过夜；37 ℃孵育HRP 标记的山羊抗兔IgG（1∶500），DAB 染色，苏木素染核。显微镜下观察肠道组织中beclin-1和LC3-II蛋白情况：beclin-1和LC3-II目的蛋白为胞质、胞核中棕褐色团状物质。蛋白阳性率（%）=阳性细胞/总细胞×100%。

3.6 Western blot 检 测 肠 道 组 织 中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、NLRP3、ASC、caspase-1 和pro-caspase-1 蛋白水平 从-80 ℃冰箱中取肠道组织30 mg，手术剪剪碎，添加蛋白裂解液，冰上研磨后冰上裂解20 min，10 000×g、4 ℃离心20 min，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，每孔上样30 μg，凝胶电泳分离蛋白，PVDF 转膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入Ⅰ抗［Akt（1∶10 000）、p-Akt（1∶500）、mTOR（1∶10 000）、pmTOR（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、pro-caspase-1（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）］；对应加入Ⅱ抗羊抗兔IgG（1∶5 000），室温孵育2 h。DAB 显色试剂显色，蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。

4 统计学处理

数据均采用GraphPad Prism 7.0 进行统计学分析。计量数据以平均数±标准差（mean±SD）表示，组内比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 DEX对肠道组织形态的影响

假手术组肠上皮细胞大小均匀一致、排列整齐紧密，层次分明，无明显病理改变；模型组肠道组织完整性破坏严重，存在坏死脱落细胞，炎症浸润现象明显，基底面细胞染色较深，细胞挤压明显，游离面细胞有不同程度溃损；DEX 组肠道组织屏障较为完整，细胞形态清晰，无明显细胞碎片脱落，炎症浸润较轻；DEX+NVP-BEZ235组细胞形态改变，游离面排列不平整，胶原带增生明显，炎症浸润明显；DEX+3-MA 组肠道完整破坏，基底面细胞排列紊乱，胶原带增厚，细胞形态破坏严重，有较多游离的细胞碎片，见图1。

Figure 1. The morphological changes of rat intestinal tissues in the 5 groups. A：sham group；B：model group；C：DEX group；D：DEX+NVP-BEZ235 group；E：DEX+3-MA group. The black star indicates the collagen band. The scale bar=100 μm.图1 各组大鼠肠道组织形态变化

与假手术组相比，模型组、DEX 组、DEX+NVPBEZ235 组和DEX+3-MA 组CMDI 评分显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，DEX 组和DEX+NVP-BEZ235组CMDI 评分显著降低（P＜0.05）；与DEX 组相比，DEX+3-MA 组CMDI 评 分 显 著 升 高（P＜0.05），见图2。

Figure 2. The colon macroscopic damage index（CMDI）in each group. Mean±SD. n=10.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group.图2 各组大鼠结肠标本CMDI评分

2 DEX对血清中IL-1β和TNF-α水平的影响

与假手术组相比，模型组、DEX 组、DEX+NVPBEZ235 组和DEX+3-MA 组血清中IL-1β 和TNF-α 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，DEX 组和DEX+NVP-BEZ235 组血清中IL-1β 和TNF-α 水平显著降低（P＜0.05），DEX+3-MA 组血清中IL-1β水平显著 降 低（P＜0.05）；与DEX 组 相 比，DEX+NVPBEZ235 组和DEX+3-MA 组血清中IL-1β 和TNF-α 水平显著升高（P＜0.05），见图3。

Figure 3. Comparison of serum levels of IL-1β and TNF-α in the 5 groups. Mean±SD. n=10.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group.图3 5组血清中IL-1β和TNF-α水平比较

3 DEX 对肠道组织中beclin-1 和LC3-II 蛋白的影响

与假手术组相比，模型组、DEX 组、DEX+NVPBEZ235 组和DEX+3-MA 组肠道组织中beclin-1 和LC3-II 蛋白阳性率升高（P＜0.05）；与模型组相比，DEX 组肠道组织中beclin-1 和LC3-II 蛋白阳性率升高（P＜0.05），DEX+3-MA 组肠道组织中beclin-1 和LC3-II 蛋白阳性率降低（P＜0.05）；与DEX 组相比，DEX+NVP-BEZ235 组和DEX+3-MA 组肠道组织中beclin-1 和LC3-II 蛋白阳性率降低（P＜0.05）；与DEX+NVP-BEZ235 组相比，DEX+3-MA 组肠道组织中beclin-1蛋白阳性率降低（P＜0.05），见图4。

Figure 4. The protein expression of beclin-1 and LC3-II in intestinal tissues of the rats in the 5 groups was detected by immunohistochemical staining（scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=10.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group；△P＜0.05 vs DEX+NVP-BEZ235 group.图4 免疫组化检测各组大鼠肠道组织中beclin-1和LC3-II蛋白的表达情况

4 DEX 对 肠 道 组 织 中Akt、p-Akt、mTOR、pmTOR、NLRP3、ASC、caspase-1 和pro-caspase-1 蛋白水平的影响

5组肠道组织中Akt、mTOR 和pro-caspase-1蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与假手术组相比，模型组、DEX 组、DEX+NVP-BEZ235 组和DEX+3-MA组 肠 道 组 织 中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋 白 水 平 升 高（P＜0.05）；与模型组相比，DEX 组和DEX+NVP-BEZ235组肠道组织中p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白水平升 高（P＜0.05），NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋白水平降低（P＜0.05），DEX+3-MA 组肠道组织中p-Akt/Akt 蛋白水平升高（P＜0.05），NLRP3 和ASC 蛋白水平降低（P＜0.05）；与DEX 组相比，DEX+NVP-BEZ235 组和DEX+3-MA 组肠道组织中p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋 白 水 平 降 低（P＜0.05），NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋 白 水 平 升高（P＜0.05）；与DEX+NVP-BEZ235 组相比，DEX+3-MA 组肠道组织中NLRP3 蛋白水平升高（P＜0.05），ASC蛋白水平降低（P＜0.05），见图5。

Figure 5. The protein levels of Akt，p-Akt，mTOR，p-mTOR，NLRP3，ASC，caspase-1 and pro-caspase-1 in intestinal tissues of the rats in the 5 groups were detected by Western blot. Mean±SD. n=10.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group；△P＜0.05 vs DEX+NVP-BEZ235 group.图5 Western blot检测各组大鼠肠道组织Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、NLRP3、ASC、caspase-1和pro-caspase-1蛋白水平

讨 论

DEX 作为临床上常用麻醉药物辅助剂，在重症监护室可镇定插管或呼吸机患者，安全性较高，较大剂量也不会损害心、肝、肾等重要器官，危害小［8］。随着研究深入，在临床上使用DEX 可以降低炎症因子，减轻水肿，在脓毒症中具有较高潜在价值［9］，但具体机制尚需进一步研究，为探讨其机制进行本研究。在本研究结果，脓毒症大鼠肠道组织完整性遭到破坏，细胞脱落和炎症浸润现象明显，出现明显的病理损伤；经DEX治疗后大鼠肠道组织恢复完整性，仅存在部分细胞脱落和炎症浸润现象，且炎症因子IL-1β 和TNF-α 水平降低。这提示DEX 能够修复由于脓毒症造成的肠道功能破坏，缓解脓毒症大鼠中的炎症，具体机制尚需进一步探究。

本研究结果显示脓毒症大鼠肠道组织NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋白水平均处于升高状态。NLRP3炎症小体可活化ASC和caspase-1从而引起促炎因子IL-1β 的成熟和释放，促进炎症反应［10］；且NLRP3与脓毒症的多器官损伤关系密切，在脓毒症大鼠中抑制NLRP3 炎症小体活化可抑制caspase-1 和IL-1β 释放，从而稳定血管内皮钙黏蛋白，缓解脓毒症引起的肺损伤［11］。DEX 在脓毒症患者中能够减轻NLRP3炎症小体从而减轻脓毒症诱发的肾损伤［12］，提示脓毒症大鼠肠道组织中NLRP3 炎症小体处于激活状态，活化的炎症小体促进促炎因子IL-1β 和TNF-α 的表达，加重炎症反应。添加DEX 后能够抑制NLRP3炎症小体的激活，进而减轻炎症指标，缓解炎症损伤。

炎症损伤导致细胞自噬增多，脓毒症引发的多脏器功能衰竭器官中也存在自噬增多现象［13］。Akt/mTOR 通路作为自噬调节最经典的mTOR 信号转导通路，在脓毒症大鼠中处于激活状态，且自噬小体水平升高，机体处于自我保护状态［14］。beclin-1 是自噬活化的关键因子，LC3是自噬重要标志蛋白［15］。DEX能够激活Akt/mTOR 通路，降低促炎因子水平，从而减轻七氟醚诱导的大鼠炎症损伤［16］。本研究中脓毒症大鼠肠道组织中p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白水平及beclin-1 和LC3-II 蛋白阳性率升高，提示脓毒症大鼠肠道组织处于自噬激活状态，但本研究中脓毒症大鼠肠道组织中炎症因子水平升高，可能是自噬能力有限，整体上导致炎症加剧。添加DEX 后p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 的蛋白水平及beclin-1 和LC3-II 蛋白阳性率进一步升高，提示添加DEX 后能进一步促进自噬，自噬清除炎症因子，缓解炎症。进一步研究显示，分别在DEX的基础上添加Akt/mTOR通路抑制剂和自噬抑制剂后，beclin-1 和LC3-II 蛋白阳性率降低，炎症因子IL-1β 和TNF-α 水平升高，提示Akt/mTOR 通路抑制剂与自噬抑制剂功能类似，DEX通过激活Akt/mTOR 通路而促进自噬，进而减轻炎症反应，实现对脓毒症大鼠肠道组织损伤的缓解。

综上所述，DEX 能够激活Akt/mTOR 通路而促进自噬、减轻炎症，从而实现对脓毒症大鼠肠道的保护。但DEX与信号通路之间的具体调控尚需进一步研究。