妊娠期糖尿病患者口腔菌群和肠道菌群特征分析

2021-10-20张欣王佩马良坤刘俊涛赵继志

实用口腔医学杂志 2021年5期

张欣王佩马良坤刘俊涛赵继志

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是最常见的妊娠并发症之一，表现为糖代谢异常，与胰岛素抵抗和慢性炎症密切相关。目前GDM的发病机制尚完全未明了，且治疗方法相对有限[1-2]。人体微生物组被称为人类第二基因组，是内分泌系统和免疫系统的重要组成部分，与疾病和健康密切相关[3]。研究证实口腔菌群与肠道菌群在心脑血管疾病，类风湿性关节炎，糖尿病等多种系统疾病的发生发展中发挥着重要的作用[4]。牙周疾病与妊娠关系密切，牙龈炎症可随孕程进展加重，且慢性牙周炎被证实是先兆子痫、GDM、早产和低体重儿的危险因素[5-7]。研究表明牙周致病菌牙龈卟啉单胞(Porphyromonasgingivalis)在口腔的定植可能引起肠道菌群结构紊乱变，引发肠道炎症，与血糖变化水平相关[4,8-10], 提示口腔菌群可能通过单独作用或与肠道菌群交互作用等形式参与了GDM的发病机制。关于口腔菌群以及肠道菌群与GDM关系的研究较少，口腔菌群多取自于唾液样本,且研究结果不一[2,11-12]。

本研究旨采用16S rRNA基因扩增子测序技术进一步分析GDM患者口腔菌群和肠道菌群的特点，为GDM的临床诊断和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究共纳入中孕期(孕24～28 周)妇女51 例，其中GDM组11 例，健康对照组40 例。研究对象来自参加本课题组“妊娠期肠道微生物队列研究”孕中期的孕妇，均招募于自北京协和医院普通产科门诊，于孕13+6周前首次建档并入组，规律产检。排除标准：入组时患消化系统疾病如胃炎、胃溃疡、炎症性肠病(溃疡性结肠炎或克罗恩病)；患高血压、糖尿病、血脂异常等代谢疾病；系统性红斑狼疮等免疫疾病；合并恶性肿瘤；近3 个月内服用过抗生素或抗菌素；患妊娠期高血压，子痫前期和子痫；孕期服用过抗生素和益生菌；孕期曾接受过口腔检查和治疗。

GDM的诊断在孕24～28 周时进行，根据中华医学会妇产科学分会及围产医学分会制定的《妊娠合并糖尿病诊治指南(2014)》，行标准化口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，口服75 g糖，如服糖前及服糖后1、2 h(分别标注为OGTT.0 h，OGTT.1 h和OGTT.2 h)，3 项血糖值中任何一项达到或超过5.1、10.0、8.5 mmol/L(92、180、153 mg/dl)，即诊断为GDM。

1.2 口腔检查及样本采集

1.2.1 唾液样本采集唾液样本在OGTT检测当天的上午8～11 时于产科门诊采集，受试者当天不刷牙，采集前用清水漱口，用5 mL无菌离心管收集无刺激性唾液约2 mL，低温运输至实验室-80 ℃保存。

1.2.2 口腔检查所有受试者在口腔科门诊经由同一名口腔科医师进行口腔检查，口腔检查时记录龋失补指数(decayed, missing, filled teeth,DMFT)和牙周临床指标包括探诊深度(probing depth,PD)和探诊后牙龈出血指数(bleeding index,BI),并计算平均PD(mean PD)和平均BI(mean BI)值。

1.2.3 牙菌斑样本采集口腔检查后即刻采集牙菌斑样本，棉卷隔湿后用无菌刮治器分别采集指数牙16，17，11，26，27，36，37，31，46，47近中牙面的龈上和龈下集合菌斑，分置于1.5 mL无菌离心管中，低温运输至实验室于-80 ℃保存。

1.2.4 粪便样本收集粪便样本由受试者在家中自行采集，排便在一次性便盆内，取便中末段内部标本，置于收集管保存液中。

1.3 DNA提取和测序

采用十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)方法提取样本基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度后，使用带Barcode的特异引物515F-806R对16S rDNA的V4测序区域进行特异性扩增。

PCR产物混样和纯化后，使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(Illumina公司,美国)建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用HiSeq2500 PE250进行上机测序。

1.4 数据处理和分析

1.4.1 测序数据处理根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V 1.2.7, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)，对每个样本的reads进行拼接，从而获得原始Tags数据。参照Qiime(V 1.9.1 http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.h tml)的Tags质量控制流程，过滤处理后得到高质量的Tags数据。随后去除嵌合体序列，得到最终的有效数据。

1.4.2 OTU聚类和物种注释利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)对所有样本的全部 Effective Tags进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)，根据OTUs聚类结果，用Mothur方法与SILVA132(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)。使用MUSCLE(Version 3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/)软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。最后对各样本的数据进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析和Beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。

1.4.3 功能预测提取KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库原核生物全基因组16S rRNA基因序列并利用BLASTN算法将其比对到SILVA SSU Ref NR数据库(BLAST bitscore>1500)建立相关矩阵，将通过UProC(ultra-fast protein domain classification)注释的KEGG数据库原核生物全基因组功能信息对应到SILVA数据库中，实现SILVA数据库功能注释。测序样品以SILVA数据库序列为参考序列聚类出OTU，进而获取功能注释信息。

1.5 统计学分析

唾液样本用A表示，牙菌斑样本用B表示，肠道样本用C表示，其中G代表GDM组，H代表健康对照组。两组间物种多样性差异用T-test或Mann-Whitney-Wilcoxon检验进行分析，利用MetaStat方法进行物种显著性差异分析。Spearman相关性分析方法分析物种丰度与临床相关指标的关系。

2 结果

2.1 研究对象基本情况

纳入中孕期(24～28 周)妇女51 例，其中GDM组11 例，健康对照组40 例，两组间在年龄，孕前体重，整个孕期增重，孕次，产次，孕周以及口腔健康指标，包括平均探诊深度，平均探诊出血水平，龋失补牙数上均无显著差异。GDM组OGTT.0 h，OGTT.1 h, OGTT.2 h的血糖水平均显著高于健康对照组(P<0.05)(表 1)。

表 1 研究对象基本情况

2.2 物种注释情况

通过对Reads拼接，平均每样品测得88 406 条tags，经过质控平均得到84 447 条有效数据，质控有效数据量达75 707，质控有效率达85.69%。以97%的一致性将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units)，共得到12 139 个OTUs，然后对OTUs序列与Silva132数据库进行物种注释。其中，能够注释到数据库的OTUs数目为 12 119(99.84%)，注释到界水平的比例为99.84%，门水平的比例为91.88%，纲水平的比例为85.62%，目水平的比例为74.98%，科水平的比例为63.76%，属水平的比例为37.60%，种水平的比例为10.93%。

2.3 GDM组和健康对照组间的比较

2.3.1 OTUs分析图 1的结果显示，在唾液，牙菌斑和肠道样本中，GDM组的OTU数均小于各自对照组。牙菌斑样本的OTU数最多，肠道和唾液样本间无明显差异。

2.3.2 各组间Top10丰度菌群的比较如图 2所示唾液，牙菌斑，肠道3 类样本top10丰度菌群的比例在门、属水平上均存在明显差异，在同类样本中GDM组和健康组间top10丰度菌群构成比类似，属水平上GDM组唾液中拟杆菌属(Bcteroides)的丰度以及牙菌斑中叶杆菌属(Phyllobacterium)的丰度均高于各自的健康对照组。

图 1 基于OTU的韦恩图

图 2 门和属水平TOP10菌群累积柱状

2.3 Alpha多样性的比较

Alpha多样性比较的结果示3 类样本中GDM组observed-species指数和chao1指数均低于各自的健康对照组，但差异不具有统计学意义(P<0.05)(图 3)。

图 3 GDM组和健康对照组菌群alpha多样性指数的比较

2.4 Beta多样性和Tax4Fun功能预测的比较

如图4所示牙菌斑、唾液和肠道样本基于 Beta多样性的 PCoA 在不同类型样本间呈现很好分离，各自聚类，同类型样本GDM组与健康组聚集，显示不同类型样本间菌群结构有显著差异性，同类样本的GDM组与健康组间的差异不明显。肠道样本的功能与牙菌斑和唾液样本功能分类聚合，其功能组成存在明显差异。唾液样本和牙菌斑样本功能分离不明显。整体水平上同类样本中GDM组和健康对照组功能差异均不明显。

图 4 基于主成分1和2的weighted PCoA图(A)和Tax4Fun功能注释PCA图(B)

2.5 GDM组和健康组差异菌属分析

Metastat分析的结果显示在属水平，唾液样本和牙菌斑样本中GDM组气单胞菌属(Aeromonas)的丰度均显著低于健康对照组(P分别为0.044和0.048)。唾液样本中代尔夫特菌属(Delftia)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)的丰度均显著低于健康对照组(P分别为0.011和0.044)。肠道样本中GDM组嗜血杆菌属(Haemophilus)的丰度显著低于健康对照组(P=0.019)。

图 5 GDM组和健康组Metastat分析属水平差异物种的丰度分布箱型图

2.6 菌群丰度与临床指标的相关性分析

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)的丰度不仅与牙周临床指标平均PD，平均BI显著正相关(PDr=0.396P<0.001, BIr=0.350,P<0.001)，还与OGTT.0 h显著正相关(r=0.243,P=0.001)。除此之外OGTT.0 h与Prevotella_copri的丰度显著正相关(r=0.176,P=0.016)，与Cercis_gigantea的丰度显著负相关(r=-0.159,P=0.03)。OGTT.1 h与Bacteroides dorei和Leptotrichia_sp_oral_clone_EI 013的丰度均显著正相关(r分别为0.206和0.167,P分别为0.005和0.023)。OGTT.2 h与Bacteroides_massiliensis的丰度显著正相关(r=0.149，P=0.043)，与Corynebacterium_durum的丰度显著负相关(r=-0.154，P=0.035)。

图 6 种水平菌群丰度与临床指标的Spearman相关性分析

3 讨论

本研究通过16S rRNA扩增子测序技术对中孕期11 例GDM患者和40 例妊娠期健康对照进行了口腔和肠道菌群的微生物特征分析，进一步探讨身体不同部位菌群与GDM的关系。在本研究中所有受试者除糖代谢水平不同外，在孕周，孕前BMI，孕期GWG，口腔健康指标(包括Mean PD, Mean BI, DMFT)以及年龄，孕产次上均无显著差异。两组间混杂因素匹配性良好。

本研究的结果显示在唾液，牙菌斑和肠道样本中，GDM组与各自的健康对照组相比，菌群丰富度略低，Alpha多样性指数的差异未及统计学意义；TOP10丰度菌群构成比类似，菌群Beta多样性和功能预测均无显著差异，提示孕中期三类样本核心菌群的结构和功能是相对稳定的。目前关于菌群与GDM关系的研究多关注于肠道菌群和唾液菌群，且结论不一。一项基于 PacBio SMRT 测序技术的GDM患者肠道菌群分析的结果显示：GDM患者与健康对照者之间的observed-species多样性和Shannon多样性差异显著，而Beta多样性和功能构成均无显著差异[13]。而另一项GDM肠道菌群宏基因组研究的结果发现，GDM妇女Shannon多样性低于健康对照者，但差距无统计学意义，而Beta多样性显著高于健康对照[14]。在一项以晚孕期妇女为研究对象的病例对照研究中，Xu等[2]学者利用16S rRNA测序方法同时分析了GDM患者和健康对照肠道菌群和唾液菌群的特点，肠道菌群的分析结果显示GDM组与健康组相比Alpha多样性指数以及基于weighted-UniFrac距离的Beta多样性指数均无显著差异，与本研究肠道菌群分析结果一致。唾液菌群的分析结果显示GDM组Alpha多样性指数显著低于健康对照组，Beta多样性指数无显著差异。与本研究中唾液样本中分析结果略有不同。在另一项关于唾液菌群与GDM关系的文章中，作者同样利用16S rRNA测序技术比较了晚孕期GDM患者和健康对照间唾液菌群的差异，结果显示，两组间菌群多样性和结构均无显著差异[11]，与本研究中结果一致。唾液和肠道菌群研究结果的不一致性可能与研究对象所在孕期，年龄，孕前BMI混杂因素的影响以及检测方法不同有关。

Metastat分析在属水平的结果显示，与健康对照组相比，GDM组唾液气单胞菌属，代尔夫特菌属和卟啉单胞菌属以及牙菌斑气单胞菌属水平和肠道组嗜血杆菌属水平显著降低。其中肠道组嗜血杆菌属的结果与Cortez等[15]研究中结果一致。Top10丰度菌群构成比在属水平上分析的结果显示，GDM组唾液中拟杆菌属(Bcteroides)的丰度以及牙菌斑中叶杆菌属(Phyllobacterium)的丰度均高于各自的健康对照组。而在差异菌属Metastat分析的结果中未发现唾液拟杆菌属和牙菌斑叶杆菌属在疾病组和健康组间的差异。其原因可能与组内差异大于组间差异有关。以上丰度表达差异菌属的结果均需扩大样本量进一步验证。

Spearman分析的结果显示牙龈卟啉单胞菌和Bacteroidesdorei的丰度分别与OGTT.0 h和OGTT.1 h显著相关，提示牙龈卟啉单胞菌和Bacteroidesdorei可能对GDM患者体内的血糖水平产生影响。牙龈卟啉单胞菌是重要的牙周致病菌，与牙周炎的发生和发展密切相关。研究报告显示牙龈卟啉单胞菌可以引起试验动物体内糖代谢异常和胰岛素抵抗[8]，人体内唾液和牙菌斑中的牙龈卟啉单胞菌与糖尿病患者体内血糖水平相关[9-10]。本研究的结果显示，牙龈卟啉单胞菌的水平不仅与牙周临床BI和PD显著正相关，还与OGTT-0 h的血糖水平显著正相关。与既往研究结果一致。Bacteroidesdorei水平与OGTT.1 h的显著正相关的结果与Wu等[14]的研究结果一致。