受体相互作用蛋白激酶1在小鼠实验性牙周炎模型中的作用

夏思颖 杨亚楠 闫香珍 章海兵 罗礼君

受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1，RIP1)是受体相互作用蛋白(RIP)激酶家族中的一员，它们是一类具有特异的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白，是细胞应激的重要传感器，是激活多种细胞死亡途径并控制炎症信号通路的关键调节剂[1]。RIP1与凋亡相关受体结合参与依赖半胱天冬酶(Caspase)调控的细胞凋亡[2]，也在Caspase受抑制时参与细胞坏死性凋亡[3]。同时，RIP1通过激酶依赖性和非依赖性两种方式调节炎症信号[4]。当RIP1信号传导失调可导致过度的炎症或细胞死亡，因此RIP1对生物体稳态的调控起重要作用[1]。在常见口腔疾病中，牙周炎作为一种与多种系统性疾病相关的慢性炎症性疾病[5]，目前已有研究报道称牙周炎涉及细胞凋亡[6]，但细胞坏死性凋亡对于牙周炎的发生发展的作用尚不明确。因此，本实验拟通过构建RIP1基因条件性敲除小鼠实验性牙周炎模型，进一步明确RIP1在牙周炎致病过程中的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 病例来源及分组

选择2019 年就诊于同济大学附属口腔医院的18～60 岁患者为研究对象，分为牙周炎组和牙周健康组，研究经同济大学附属口腔医院伦理委员会批准，所有标本的收集均取得患者知情同意。牙周炎组纳入标准：(1)诊断为Ⅲ～Ⅳ期牙周炎(根据2018年牙周分类标准[7]：牙间邻面最严重的位点附着丧失≥ 5 mm，影像学显示牙槽骨吸收至牙根1/2或根尖1/3)；(2)不伴有其他严重系统性疾病及免疫系统疾病的患者。牙周健康组纳入标准[8]：(1)牙周组织健康，其特征为无探诊出血、牙龈无红肿、无附着丧失和无牙槽骨骨丧失；(2)不伴有其他严重系统性疾病及免疫系统疾病。

1.2 实验动物

本研究采用无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级小鼠，对照组为野生型(WT)C57/BL6小鼠，实验组为相同背景下巨噬细胞条件性敲除RIP1基因的小鼠(RIP1-/-)。所有小鼠均为6～8 周龄雄性小鼠，适应性饲养1 周后建立牙周炎模型。

1.3 Western blot分析

实验组为牙周炎组患者在行翻瓣术中收集的牙龈组织，对照组为牙周健康组患者行阻生齿拔除术中收集的牙龈组织。组织在液氮中充分研磨，加入RIPA裂解液(P0013B，碧云天)和1% Cocktail tablets蛋白酶抑制剂(Bimake公司, 美国)，冰上裂解30 min后离心, 收集上清，BCA法(碧云天)检测浓度。加入上样缓冲液后置于100 ℃金属浴中10 min，每组取含20 μg蛋白等体积行SDS-PAGE电泳及转膜(Millipore公司，美国)，用5%脱脂奶粉室温下封闭90 min，加入RIP1(1∶1 000)及GAPDH(1∶5 000)一抗4 ℃过夜。TBST洗膜3 次，每次15 min，加入荧光二抗避光孵育2 h，同样方式洗膜，双色红外激光成像系统(LI-COR公司，美国)进行荧光显影，使用Image J绘制定量图。

1.4 小鼠牙周炎模型的建立

分别选取6 只6～8 周RIP1条件性敲除(RIP1-/-)小鼠及6 只6～8 周野生型(WT)C57/BL6小鼠，通过腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)进行麻醉，在右侧上颌第二磨牙牙颈部用5-0丝线结扎诱导牙周炎。7 d后将各组小鼠颈脱位法处死，取上颌骨用4%多聚甲醛固定, 运用Micro CT(μCT50，SCANCO，瑞士)进行扫描成像后测量各组小鼠右侧上颌第二磨牙颊侧牙尖和沟裂及腭侧牙尖和沟裂的釉牙骨质界到牙槽嵴顶(cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC)的距离，分析牙槽骨丧失量(alveolar bone loss,ABL)。

1.5 RNA提取、逆转录和qRT-PCR

提取各组小鼠上颌骨对照侧及实验侧牙龈组织，在液氮中充分研磨，TRIZOL法提取各组RNA，检测浓度后每组取1 μg RNA采用逆转录试剂盒(Takara公司，日本)逆转录为cDNA后，使用基因特异性引物和SYBR GREEN qRT-PCR试剂盒(Roche公司，瑞士)检测两组小鼠牙龈组织相关炎症因子mRNA水平的表达差异。引物序列见表 1。

表 1 实时荧光定量PCR引物序列

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 牙周炎患者牙龈组织中RIP1蛋白的表达量

Western blot结果显示，牙周炎患者牙龈组织中RIP1蛋白表达明显低于牙周健康者(图 1)。

2.2 RIP1-/-敲除小鼠的实验性牙周炎中牙槽骨丧失量增多

Micro CT三维重建分析结果显示，建立实验性牙周炎模型的RIP1-/-小鼠患侧的牙槽骨丧失量均大于WT组小鼠(图 2)。说明抑制小鼠体内RIP1的表达可以加重其实验性牙周炎牙槽骨的吸收。

2.3 RIP1-/-小鼠的牙龈组织中炎症因子表达

qRT-PCR(LightCycler96，Roche，瑞士)检测野生型小鼠及RIP1敲除小鼠牙龈组织相关炎症因子TNF-α(A)、IL-6(B)、iNOS(C)、IL-11(D)、Arg-1(E)和IL-10(F)mRNA的相对表达量。

qRT-PCR结果显示，在未建立牙周炎模型的对照侧牙龈组织中，RIP1-/-组小鼠相比于WT组小鼠促炎因子TNF-α、IL-11及抑炎因子IL-10的mRNA表达升高，在已建立牙周炎模型的实验侧牙龈组织中，RIP1-/-组小鼠相比于WT组小鼠促炎因子IL-6、IL-11及抑炎因子IL-10的mRNA表达升高，促炎因子iNOS的表达反而降低(图 3)，同时，WT组小鼠的实验侧牙龈组织中抑炎因子Arg-1与对照侧相比有所升高，而RIP1-/-组小鼠的实验侧牙龈组织中促炎因子IL-6和抑炎因子Arg-1与对照侧相比有所升高，结果说明抑制小鼠体内RIP1的表达可以改变小鼠牙龈组织中炎症因子的表达。

图 1 牙周炎患者及牙周健康者牙龈组织RIP1蛋白的表达

图 2 RIP1-/-敲除小鼠及WT小鼠上颌骨Micro CT扫描结果

图 3 野生型小鼠及RIP1-/-敲除小鼠牙龈组织相关炎症因子mRNA的表达

3 讨 论

本研究结果显示牙周炎患者的牙龈组织中RIP1表达下降，同时在巨噬细胞条件性敲除RIP1基因小鼠上建立牙周炎模型后观察到与对照组相比牙槽骨的丧失量增加，并且牙龈组织中炎症相关因子的表达趋势改变，提示抑制RIP1可能会改变小鼠本身对于炎症的反应，并且会促进小鼠牙周炎中的促炎和抗炎进程。

牙周炎作为一种慢性炎症性疾病，涉及多种细胞死亡方式。牙周炎患者牙龈组织中与凋亡相关的基因表达上升[9]，且细胞凋亡受牙龈组织中特定的腺苷受体调节[10]，并会造成成骨相关转录因子、骨钙素等的表达降低[11]。坏死性凋亡在牙周炎中的具体作用尚未明确，但已有研究表明，牙龈卟啉单胞菌通过RIP1/RIP3/混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain like pseudokinase，MLKL)信号通路诱导单核细胞的死亡[12]，并且单核细胞释放的损伤相关的分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)可以触发炎症和牙周膜成纤维细胞的坏死性凋亡[13]。也有研究显示，抑制RIP3/caspase-8可以保护牙周膜干细胞并促进炎性微环境中牙周组织再生[14]，但是，缺乏更多的研究证实与坏死性凋亡密切相关的RIP1在牙周炎中的作用。

RIP1参与炎症和多种细胞死亡方式，现有研究显示，RIP1在受到某些蛋白泛素化或去泛素化修饰时，与FADD(fas-associating protein with a novel death domain，Fas相关死亡域蛋白)、caspase-8形成复合体诱导细胞凋亡[1]；当caspase-8受抑制时，RIP1与RIP3形成复合体诱导坏死性凋亡，激活MLKL破坏细胞膜造成细胞死亡[15]。有研究报道，当抑制炎症浸润巨噬细胞中的RIP1会增加caspase-3的激活，并且改变巨噬细胞极化，发挥抑炎作用M2巨噬细胞减少而促炎相关的M1巨噬细胞增加[16]。RIP1参与NF-κB介导的炎症反应的调节，当泛素化RIP1受到与NF-κB通路正向调节物转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor β-activated kinase 1，TAK1)复合物等调控，可促进炎症反应；当RIP1受到NF-κB的负调控因子泛素编辑酶A20和去泛素化酶CYLD等作用时可发挥抑炎反应[1]。也有研究发现，造血细胞中的RIP1缺乏会刺激细胞因子及趋化因子的释放并产生一定的组织炎症后造成造血功能衰竭并影响骨髓的生成[17]。因此，根据本研究的结果推测RIP1可能参与牙周炎症的过程，但由于RIP1功能的多重性，同时炎症与细胞死亡也存在多种复杂的关联[18]以及牙周炎病因的复杂性[19]，本研究尚无法准确解释RIP1影响牙周炎的具体机制，这也是本实验中RIP1基因条件性敲除小鼠牙龈组织中促炎和抗炎因子表达趋势不同的可能原因。

在RIP1的结构中包含一个氨基端激酶域、一个中间域和一个羧基端死亡域，每个结构域的不同位点都对炎症与细胞死亡起重要作用。例如，RIP1中间域Lys377处被特异性泛素化时，对TNF-α激活NF-κB通路起关键作用[20]；RIP1中间域中的受体相互作用同型相互作用基序(receptor-interacting protein homotypic interaction motif，RHIM)与RIP3中的RHIM形成是坏死性凋亡的必需复合物[21]；RIP1的死亡结构域与FADD相互作用触发凋亡[22]。因此，未来或许可以条件性敲除RIP1中的某些位点，以进一步探究RIP1对牙周炎的具体作用及机制。

综上，本实验说明牙周炎患者牙龈组织中相比于牙周健康者RIP1的表达明显下调，同时，在小鼠体内条件性敲除RIP1基因会造成其实验性牙周炎中牙槽骨丧失量增多，并引起炎症因子的表达改变，表明RIP1可能通过调节炎症因子的表达从而影响牙周炎的发生发展，这都为进一步探究RIP1在牙周炎中的作用提供了基础。