钛表面纳米形貌在炎症环境下对巨噬细胞极化调控和炎症相关因子分泌的影响

丁鑫 何奕德 张玉梅

现有研究证实，巨噬细胞在种植体周围炎的免疫-炎症反应中具有重要作用，其吞噬功能和高度的可塑性，在维持机体免疫环境稳态中起到了重要作用[1]。其中，牙龈卟啉单胞菌是种植体周围炎的主要致病菌之一，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是其外壁的组成部分，作为一种内毒素可以与细胞膜中的Toll样受体结合，并激活下游与炎症反应相关的NFκB、MAP等激酶，从而引起炎症反应[2-3]。本课题组前期研究证实，钛表面纳米形貌对巨噬细胞极化具有调控效应[4-5]，但炎症环境下形貌因素对巨噬细胞极化的调控作用是否有所改变仍不清楚。对炎症环境下钛纳米形貌对巨噬细胞的极化状态及炎症相关因子分泌的影响进行研究，以期为生物材料的设计和有效避免种植体周围炎的发生提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

医用级纯钛试样(99.9%，直径14.5 mm，厚度1 mm,西北有色金属研究院)；小鼠巨噬细胞系 RAW264.7 细胞 (ATCC®TIB-71TM，美国)；碳化硅金相砂纸 400～7 000 目(Matador，德国)；氢氟酸、丙酮、乙醇(天津富宇化工有限公司)；去离子水(第四军医大学口腔医院药剂科)；脂多糖(上海源叶生物科技有限公司)；DMEM培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；青霉素、链霉素、胰蛋白酶(Sigma，美国)；多聚甲醛、戊二醛、六甲基二硅胺烷(天津天力化工)；Trizol@Regent、Prime ScriptTMRT Master Mix、 SYBR®Premix Ex Taq TMII、DEPC水(Takara，日本)；抗体(CD86-FITC，CD206-PE-Cyanine7，Rat/IgG2a-FITC Isotype Control，Rat/IgG2b-PE-Cyanine7 Isotype Control)(Invitrogen，美国)；Fixation Buffer、Permeabilization Wash Buffer(Bio Legend，美国)；引物合成(西安擎科生物技术有限公司)；Elisa检测试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司)； 阳极氧化电源(北京大华无线电仪器厂)；CO2恒温细胞培养箱(Thermo，美国)；场发射扫描电镜(HITACHI，日本)；流式细胞仪(Beckman-Coulter，美国)；实时荧光PCR仪、酶联免疫检测仪(Bio-Rad，美国)。

1.2 纯钛表面纳米管的制备与形貌观察

使用400～7 000 目砂纸将纯钛试样依次抛光至镜面，记为P组。将抛光试样置于0.5%氢氟酸和6.0%磷酸电解液中，分别采用5 V和20 V恒压直流电对试样进行阳极氧化反应，持续时间1 h，制备出不同管径纳米管试样，分别记为NT5V和NT20V组。所有试样依次在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声荡洗15 min。每组随机抽取3 个试样，采用场发射扫描电镜观察表面形貌。试样于细胞接种前用75%乙醇浸泡6 h、紫外线照射1 h后备用。

1.3 细胞培养与接种

小鼠RAW 264.7细胞株采用含10%胎牛血清和1%青/链霉素的DMEM培养基，于含5%CO2的37 ℃细胞孵箱内培养。观察细胞融合达80%以上时，将细胞用胰蛋白酶消化后按照4×104/mL/孔(24孔板)接种于各组试样表面，接种后隔天更换培养液，第3天换液后部分组加入LPS (100 ng/mL)，第4天终止培养。

1.4 实验分组

实验根据不同试样分为NC(24孔板)、P、NT5V及NT20V组，根据是否添加LPS分为LPS-组和LPS+组，每个独立实验重复3 次。

1.5 细胞在纳米形貌表面生长形态的观察

弃净培养基，用PBS清洗3次，2.5%戊二醛4 ℃过夜固定，依次使用50%、 70%、 80%、 90%、 100%、100%乙醇梯度脱水，5 min/次。完全吸净乙醇后，每孔加入200 μL六甲基二硅胺烷浸泡30 min，吸弃所有液体后自然干燥后喷金。场发射扫描电镜观察细胞形态，Image J统计测量细胞铺展面积和伸长率。

1.6 流式细胞术检测细胞M1/M2极化标志物表达

弃净培养液，PBS反复吹打后收集细胞悬液至1.5 mL离心管，1 200 r/min离心5 min。400 μL Fixation Buffer重悬细胞，室温下固定细胞20 min，350 g离心5 min，弃去上清。用PBS将10×Permeabilization Wash Buffer稀释为1×，取100 μL重悬细胞后，分别加入CD 86-FITC和CD 206-PE-Cy7抗体，并分别设置裸细胞、单染抗体以及FITC 和PE-C7同型抗体组，室温避光孵育20 min。1×Permeabilization Wash Buffer漂洗2 遍后，用400 μL PBS重悬细胞后上机检测。

1.7 实时荧光定量PCR检测细胞M1/M2相关基因

终止培养后PBS轻轻漂洗3 次，Trizol法提取各组细胞总RNA。测定各组RNA浓度，反转录成cDNA，qPCR检测细胞内iNOS、IL-11β、CD 206和IL-10的基因表达，引物序列见表 1。

表 1 qPCR目的基因引物序列

1.8 ELISA方法检测炎症相关因子分泌

收集培养上清，1 000 g离心20 min后取上清。根据试剂盒说明设置标准品孔和样本孔，标准品孔依次加入不同浓度标准品50 μL，样本空加入待测上清50 μL，每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，封板膜密封后于37 ℃恒温箱孵育60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min后甩去液体，吸水纸上拍干，重复洗板5 次。每孔分别入底物A、B各50 μL，37 ℃恒温箱避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，450 nm波长测定各孔A值，根据标志品取线计算样品组浓度。

1.9 统计学方法

2 结 果

2.1 钛表面形貌扫描电镜观察

10 000 倍观察，P组钛表面相对光滑，仅可见少量平行的划痕，NT5V组和NT20V组表面可见粗糙状结构，NT20V组可见均匀排列的管口；100 000 倍观察，NT5V组和NT20V组可见均匀分布的纳米管，测量管径分别为30 nm和100 nm左右(图 1)。

图 1 钛试样表面形貌 (SEM)

图 2 试样表面细胞生长形态观察 (SEM, ×2 000)

2.2 细胞形态观察和分析

巨噬细胞在不同试样表面上正常培养4 d后，形态存在较为明显的差异。NC组和P组中，细胞成圆球状，体积较小，无明显伸长，也无伪足伸出； NT5V组，细胞略呈“梭形”，具有向两极生长的趋势，细胞两极可见伪足伸出； NT20V组，细胞整体仍呈圆形铺展，可见大量“放射状”伪足伸出。经LPS刺激24 h后，各组细胞形态均发生显著变化：细胞体积明显增大且伸展出大量伪足，细胞间存在较多伪足联系； P组和NT5V组细胞呈更为明显的两极化伸展，NT5V组可见较为粗大的板状伪足且“梭形”更为明显； NT20V组细胞呈更为明显的“放射状”伸展，细胞体积更大。

每个试样表面随机挑选3 个视野的细胞采用Image J 软件测量细胞面积和细胞伸长率(细胞长轴/宽度×100%)，结果显示NT20V组细胞伸展面积最大，而NT5V组细胞伸长率最大(P<0.05)；经LPS刺激后，各组细胞伸展面积均显著增大(P<0.05)，其中NT20V组细胞伸展面积最大，NT5V组伸长率最大，与其他各组均有统计学差异(P<0.05)(图 3)。

2.3 巨噬细胞M1/M2极化标志物表达比较

流式细胞术检测巨噬细胞M1/M2极化标志物结果显示，巨噬细胞正常培养4 d后，P和NT5V组CD206阳性率值显著高于其他组(P<0.05)，NT20V组CD 86阳性率最高，但与P组间无显著差异(P>0.05)；经LPS刺激后24 h后，各组CD 86和CD 206表达均有所升高，其中NT5V组CD 206阳性率最高，而NT20V组CD 86阳性率值最高(P<0.05)(图 4)。

图 3 试样表面细胞生长形态的测量

图 4 不同钛表面形貌及LPS刺激对巨噬细胞M1/M2极化标志物的影响

2.4 巨噬细胞M1/M2极化相关基因表达比较

实时荧光定量PCR检测巨噬细胞极化细胞内标志物基因的表达水平结果显示，正常培养4 d后，NT5V组IL-10和CD 206表达均显著高于其他组，NT20V组iNOS和IL-1β表达显著高于其他各组；与NC组相比，P组iNOS表达显著升高(P<0.05)。经LPS刺激24 h后，各组的iNOS、IL-1β和CD 206表达均显著升高，NC组和NT20V组iNOS表达显著高于其他两组，NC组IL-1β表达较其他组最高(P<0.05)； NT5V组IL-10和CD 206的表达显著高于其他各组(P<0.05)(图 5)。

2.5 巨噬细胞炎症相关因子分泌比较

ELISA方法检测巨噬细胞炎症相关因子分泌结果显示，正常培养4 d后，NT20V组分泌IL-1β和TNF-α显著高于其他各组，P组和NT5V组分泌IL-4和IL-10较其他两组更高(P<0.05)。经LPS刺激24 h后，与NT5V组相比，NC组和NT20V组IL-1β和TNF-α分泌更高(P<0.05)；与NC组相比，其他各组IL-4分泌水平均显著升高，NT5V组分泌IL-10显著高于其他各组(P<0.05)(图 6)。

图 5 不同形貌及LPS刺激对巨噬细胞M1/M2极化相关基因表达的影响

图 6 不同形貌及LPS刺激对巨噬细胞相关炎症因子分泌水平的影响

3 讨 论

除手术创伤以外，口腔致病菌在术中以及术后也存在对骨结合及种植远期成功造成影响的风险[6]。在包括炎症反应、创伤愈合、致病菌清除等一系列免疫反应中，巨噬细胞起到了免疫调控的关键作用。针对不同的炎症微环境巨噬细胞自身可以表现出向不同表型极化特点，例如，LPS和干扰素-γ(IFN-γ)可以促巨噬细胞向M1型极化，分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎因子，并表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)以抵抗感染；而在创伤愈合过程中，其在白介素4(IL-4)等抗炎因子诱导下向表现为向M2型极化方向转变，并分泌IL-10、精氨酸酶-1(Arg-1)等抗炎因子以促进组织修复、愈合[7-8]。Galarraga-vinueza等[9]在种植体周围炎患者临床检查并对组织病理进行免疫组化染色中发现，种植体周围组织中巨噬细胞的M1极化标志物CD 86表达程度与临床探诊深度呈正相关。

既往的研究发现，在免疫反应过程中巨噬细胞需要在M1和M2极化状态中保持相对平衡，才能有效抑制炎症反应向急性或病理性反应转化，如何人为干预或调控免疫过程中巨噬细胞极化方向及其比例一直是研究的热点。已有研究证实，通过对生物材料表面微/纳米级形貌进行设计可以实现调控巨噬细胞极化的目的[10]。本课题组前期研究发现，钛表面不同管径的纳米管形貌对巨噬细胞极化的影响不同，大管径的纳米管倾向于促进巨噬细胞M1极化，而小管径纳米管更有利于巨噬细胞M2极化[4-5]。但在炎症环境下，上述形貌对巨噬细胞计划方向的影响是否有所改变仍不清楚。基于以上研究背景，本研究采用30 nm和100 nm管径纳米形貌，观察牙龈卟啉单胞菌来源LPS刺激的炎症微环境下，钛表面纳米形貌对巨噬细胞极化状态和炎症相关因子分泌情况的影响。本研究中使用的RAW264.7细胞为小鼠来源的巨噬细胞系，其作为巨噬细胞研究模型已被广泛应用，可以表征常见的巨噬细胞表型[11]；LPS已被证实可以在体外诱导不同类型细胞发生炎症反应[12-13]。

本研究中，正常培养条件下不同管径纳米管对RAW264.7细胞的极化调控及炎症相关因子分泌影响与前期结果相一致。经LPS刺激巨噬细胞由圆球状变为“放射状伸展”且胞体明显增大，M1极化标志物CD 86及相关基因iNOS和IL-1β表达增高，证明100 ng/mL LPS刺激24 h后RAW264.7细胞向M1型转化。在NT20V组表面，细胞由圆球形向圆饼状铺展并伸展出“放射状”伪足，M1型标志物CD 86高表达；而在NT5V组表面，细胞沿长轴伸长呈“梭形”，M2型标志物CD 206高表达；与P组和NT5V组相比，NT20V组M1极化标志iNOS和IL-1β基因表达显著升高。LPS刺激是文献报道中经典的诱导巨噬细胞M1极化的方法，但有研究报道，不同剂量与刺激时间对极化方向和M1/M2比例存在不同影响[14]；此前研究发现100 nm管径纳米管诱导巨噬细胞M1极化，而本研究中NT20V表面巨噬细胞经LPS刺激后IL-1β基因表达较NC组低，IL-1β分泌也未显著增加，M1极化NT20V组也并未产生“叠加效应”，此结果提示钛纳米材料在炎症微环境下与NC组相比，M1极化及炎症相关因子均受到了不同程度的抑制。研究表明，IFN-γ/LPS和100 nm管径纳米管形貌是通过两种不同的机制诱导巨噬细胞M1向极化[15]。因此，纳米形貌是否能够有效抑制炎症环境下的巨噬细胞M1极化及相关炎症因子的分泌还有待进一步研究证实。

本研究中发现，NT5V组具备良好的促巨噬细胞M2极化以及促进抑炎因子分泌的性能。扫描电镜下观察在30 nm管径纳米管表面，巨噬细胞呈长梭形伸展，这表明了材料对于细胞极化方向的诱导效能。NC组经LPS刺激后，细胞体积明显增大并呈“放射状”伸展，CD86、iNOS及IL-1β表达显著升高，而NT5V组经LPS刺激后M1相关标志物和基因虽有升高但均低于其他组；M2相关标志物和基因以及促炎相关因子分泌均显著高于其他组，这提示30 nm管径纳米管可能通过诱导并限制细胞形貌及伸展从而抑制其向M1方向极化，同时维持细胞M2极化特性。Jain等[16]发现通过限制细胞体积与伸展可以显著抑制LPS刺激下巨噬细胞M1向极化以及炎症相关基因的表达；去除限制后，细胞可向M1向极化；去除LPS刺激后，细胞还可以向M2转化。因此可以推测，30 nm管径纳米管在LPS刺激的炎症环境中，可以维持巨噬细胞M2极化状态并促进相关抑炎因子的分泌。Chistiakov等[17]和Colin等[18]发现 IL-1β/LPS或免疫复合物刺激下可以诱导巨噬细胞向M2b方向极化，其特征是IL-10高表达。本研究中发现，经LPS刺激后，M2极化标志物及相关基因表达均有所升高，其中IL-10最为显著。生物材料作为外源性刺激，植入生物体内会引起宿主的免疫反应，相关炎症因子分泌并诱导巨噬细胞产生吞噬作用，同时分泌抑炎因子促进血管生成、组织愈合，这可能是本研究中经LPS+和N组间抗炎症相关因子分泌无明显差异的原因。

综上所述，本研究结果显示，30 nm管径纳米管促RAW 264.7细胞M2极化，100 nm管径纳米管促RAW264.7细胞M1极化；细胞经LPS刺激后钛纳米管形貌可以一定程度地抑制细胞M1极化相关基因的表达，30 nm管径钛纳米管形貌可以显著促进巨噬细胞M2极化及抑炎相关因子的分泌。由于种植体周围炎的发生受到多种因素的影响，巨噬细胞在行使功能过程中并不能简单地划分为M1或M2极化，M1/M2比例及如何诱导M2方向转化可能更为重要，因此，钛纳米形貌在炎症环境中对巨噬细胞极化调控及相关炎症因子分泌的影响及其内在机制还有待进一步深入研究。