理中汤加味对大鼠复发性口腔溃疡黏膜的修复作用及对NF-κB炎症通路的影响

高峻鹰 李庆隆 耿乾书

复发性口腔溃疡(recurrent oral ulcer，ROU)，又称为复发性阿弗他性口炎，是口腔溃疡性疾病的常见形式，最常见形式，影响着全球多达5%～20%的人口，其特点是该病可在口腔黏膜的任何位置出现一个或多个圆形或椭圆形的溃疡，具有良性和自限性的特点，但经常复发，伴有明显的疼痛，常导致患者口腔功能障碍[1-2]。ROU的治疗包括含漱剂、含片、散剂、局部封闭等局部治疗方法，以及免疫抑制剂、免疫调节剂和增强剂等全身治疗方法，但在治疗期间患者依从性较差，整体治疗效果不佳[3]。近年来，中医药在临床广泛使用，对ROU的治疗表现出明显优势，可预防患者口腔溃疡远期发作[4]。中医理论认为，口腔溃疡与正气亏虚、脾胃虚寒有关[5]。理中汤具有补气健脾、温中祛寒之功效，已有多项研究报道，理中汤及其加味方对ROU疾病具有较好的治疗效果，能够使溃疡面积缩小，疼痛减轻，胃脘疼痛、反酸烧心等其他伴有症状亦得到明显改善，但其作用机制尚不清晰[6～7]。长期以来，NF-κB信号通路被认为是经典的促炎信号转导途径，IκB在IKK的激活作用下被磷酸化，磷酸化的IκB被进一步泛素化而被蛋白酶降解，释放出NF-κB二聚体并进入细胞核，NF-κB信号通路被激活后，可增加TNF-α等基因的转录，进而增加炎症因子的释放，激活机体的炎症反应并使其扩大化和持续化[8～9]。免疫法ROU模型，即通过弗氏佐剂和口腔黏膜组织均浆建立的大鼠ROU模型，从症状表现和病理学检查方面均与人类ROU的发作相似，可从造模后第3周至第8周内持续出现多个溃疡病灶，目前已被广泛用于口腔溃疡实验研究中[10～11]。本研究通过免疫法建立大鼠ROU模型探讨理中汤加味对大鼠ROU的修复作用及其对NF-κB炎症通路的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

72 只6 周龄Wistar大鼠(180～220 g)，雌雄各半(北京维通利华实验动物技术有限公司)。许可证号：SCXK(京)2017-0011。饲养条件：室温(22±2)℃，湿度(50±10)%，每天定时换气，保持12 h：12 h光暗照明，食水不限。

1.2 药品与试剂

理中汤加味方(党参、黄芪、茯苓各20 g，白术、干姜各15 g，炮附子、五味子、山药各10 g，炙甘草5 g，康美药业股份有限公司)；醋酸泼尼松龙注射液(浙江仙琚制药股份有限公司)；完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich,美国)；ELISA试剂盒(武汉Elabscience公司)；实验所需兔单抗及羊抗兔二抗(CST公司，美国)；苏木精和伊红染色液、ECL发光液(北京Solarbio公司)。

1.3 方法

1.3.1 分组与造模 随机选取12 只大鼠，于无菌环境下在其口腔黏膜处注射生理盐水，剥离口腔黏膜，放置于组织研磨器中，加入0.1 mol/L，pH=7.4的PBS缓冲液研磨成匀浆，再加入等量的完全弗氏佐剂，混合均匀直至呈无分层的乳状液，即为组织乳化剂。将剩余的60 只大鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、阳性对照组及理中汤高剂量、中剂量和低剂量组，除正常组之外的其余组大鼠均采用免疫法建立ROU模型，具体方法：将各组大鼠脊柱两侧脱毛备皮，消毒，在脊柱两侧分别皮内注射0.1 mL组织乳化剂，每周1次，连续8周，正常组大鼠采用同样的方法在相同位置注射等体积的生理盐水[11]。8 周后，观察各组大鼠口腔溃疡形成情况，模型组、阳性对照组、理中汤高剂量、理中汤中剂量和理中汤低剂量组大鼠均成功建立ROU模型，存活大鼠的数量分别为：8 只、9 只、9 只、9 只、8 只。大鼠的唇黏膜、颊黏膜以及口底部呈现多个呈椭圆或圆形的溃疡面，表面有灰黄色假膜，边缘整齐，直径1～2 mm。

1.3.2 药液制备 取理中汤加味方诸药，用蒸馏水浸泡12 h，其中炮附子先煎煮1 h，再加入其余药材煎煮40 min，共重复3 次，将所有药液浓缩至4 g/mL(即每毫升含生药量为4 g)，分装后储存于4 ℃冰箱备用。

1.3.3 给药方法 从第9周开始，阳性对照组大鼠灌胃给予20 mL/kg的醋酸泼尼松龙注射液(1 mg/mL)，理中汤高剂量组、中剂量组和低剂量组大鼠分别给予40、20、10 g/kg的理中汤加味方药液，给药体积为1 mL/100 g，正常组和模型组大鼠灌胃给予相同剂量生理盐水，1 次/d，连续20 d。

1.3.4 理中汤加味对大鼠口腔溃疡数量、持续和间隔时间的影响 观察并记录大鼠口腔溃疡数量、持续和间隔时间，测量给药前一天及给药后5、10、15、20 d时大鼠口腔溃疡面积，取平均值。溃疡面积(mm2)=π×d1×d2×1/4，π取值3.14，d1和d2分别为口腔溃疡的最大横径和最大纵径。

1.3.5 ELISA试剂盒检测理中汤加味对大鼠血清中炎症因子水平的影响 最后一次给药后2 h后，麻醉大鼠，通过腹主动脉穿刺取血，分离出血清用于ELISA试剂盒检测，根据试剂盒说明书制作出标准曲线，检测并计算血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.3.6 HE染色观察口腔黏膜病变 1.3.5的实验结束后，分离各组动物口腔溃疡区域的组织，分割成适宜大小的组织块后固定48 h，制作石蜡组织标本和病理切片(将石蜡组织块置于切片机上制成厚度为4 μm的组织切片)，然后行常规HE染色，封片后于光镜下观察口腔黏膜病变。

1.3.7 Western blot检测溃疡组织NF-κB炎症通路蛋白表达 取口腔黏膜组织，称重，剪碎，加入细胞裂解液研磨匀浆并离心，提取组织蛋白，并用BCA法确定浓度，按照20 μg/孔的蛋白量常规上样、电泳、转膜、封闭，把转印后的PVDF膜加入一抗溶液(1∶2 000)中4 ℃孵育过夜，次日洗膜，放入二抗溶液(1∶2 000)中在37 ℃恒温箱中孵育2 h，再次清洗后滴加适量发光试剂，放入凝胶成像仪中显影。Image J软件用于获取目标蛋白的灰度值并进行统计分析。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠口腔溃疡的改善情况

截止到取材当天，除正常组大鼠未出现口腔溃疡之外，其余组均出现口腔溃疡，溃疡面不规则，表面覆有白色假膜，周围黏膜有红肿、充血。阳性对照组、理中汤高剂量组、中剂量组和低剂量组大鼠口腔溃疡得到一定程度改善，溃疡面缩小，阳性对照药物和理中汤高剂量的治疗效果优于理中汤中剂量和低剂量组(图 1)。HE染色结果显示，正常组大鼠口腔黏膜角化层、颗粒层、棘层和基底层结构完整，可见少量淋巴细胞和红细胞外渗。模型组大鼠口腔黏膜上皮层细胞脱落，棘层松散，炎性细胞浸润明显，亦可见红细胞外渗现象。与模型组比较，其余各组大鼠口腔黏膜组织的炎症浸润程度均减轻，黏膜组织结构清晰、完整，这种作用在阳性对照组和理中汤高剂量组中更加显著(图 2)。在溃疡数量、溃疡持续和间隔时间方面，与模型组比较，阳性对照组、理中汤高剂量、理中汤中剂量和理中汤低剂量组大鼠的口腔溃疡数量、持续时间减少，间隔时间增加；与阳性对照组比较，理中汤高剂量、理中汤中剂量组大鼠口腔溃疡数量和持续时间减少，间隔时间延长，理中汤低剂量组大鼠口腔溃疡数量、持续时间则高于阳性对照组，间隔时间短于阳性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)(图 3)。复发性大鼠口腔溃疡模型具有一定自愈性，模型组大鼠的口腔溃疡面积随着时间的延长逐渐缩小，第20天时，除阳性对照组、理中汤高剂量组分别有1只和2只大鼠溃疡全部愈合外，模型组、理中汤中剂量组和低剂量组大鼠溃疡均未完全愈合。给药前一天，各组大鼠口腔溃疡面积无显著差异(P>0.05)。在给药第5、10、15、20天时，与模型组比较，阳性对照组、理中汤高剂量、理中汤中剂量和理中汤低剂量组大鼠口腔溃疡面积均显著减小，差异有统计学意义(P<0.05)。与阳性对照组比较，在给药第5、10、15、20 d时，理中汤高剂量组大鼠口腔溃疡面积显著减小，差异有统计学意义(P<0.05)，理中汤中剂量和理中汤低剂量组大鼠口腔溃疡面积变化则与阳性对照组无显著差异(P>0.05)(图 4)。

图 1 治疗20 d时各组大鼠口腔溃疡情况

图 2 治疗后各组大鼠口腔黏膜组织 (HE,×200)

图 3 各组大鼠口腔溃疡数量、持续和间隔时间比较

图 4 各组大鼠口腔溃疡面积变化

2.2 理中汤加味对大鼠血清中炎症因子水平的影响

与正常组比较，其余各组IL-1β、IL-6、TNF-α均增加；与模型组比较，阳性对照组、理中汤高剂量、理中汤中剂量和理中汤低剂量组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α均降低；与阳性对照组比较，理中汤高剂量和中剂量组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均减少，理中汤低剂量组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量则高于阳性对照组，理中汤加味对大鼠血清炎症因子的作用呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)(图 5)。

图 5 各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较

2.3 理中汤加味对大鼠溃疡组织NF-κB炎症通路的影响

与正常组比较，其余各组IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表达均增加；与模型组比较，阳性对照组、理中汤高剂量、理中汤中剂量和理中汤低剂量组大鼠口腔黏膜组织中IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表达显著升高；阳性对照组及理中汤高、中和低剂量组口腔黏膜IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表达水平低于模型组；理中汤高、中剂量组口腔黏膜IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表达低于阳性对照组，理中汤低剂量组大鼠口腔黏膜组织IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表达则高于阳性对照组，理中汤加味呈剂量依赖性改变大鼠口腔黏膜组织NF-κB炎症通路蛋白表达的作用呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)(图 6～7)。

图 6 Western blot法检测NF-κB炎症通路蛋白表达水平

图 7 各组大鼠口腔黏膜组织NF-κB炎症通路蛋白相对表达水平比较

3 讨 论

ROU是临床常见口腔黏膜疾病，在中医学属于“口疮”、“口糜”等范围，临床表现为口腔黏膜出现反复发作的浅表性溃疡，伴有灼痛，给患者的生活质量来带不同程度的影响[12-13]。ROU的发病机制复杂，可能与细菌和病毒感染、微量元素和维生素缺乏、食物和精神因素有关，西医治疗以消炎、止痛、促溃疡愈合等对症治疗为主，尚无特效药物，患者在治疗期间的依从性较差[14]。近年来，中医药在临床广泛使用，在治疗ROU疾病中具有改善患者症状、缩短病程、治愈甚至减少复发的优势[15-16]。理中汤为我国传统中医经典名方，用于治疗脾胃虚寒证，具有补气健脾、温中祛寒的功效[17]。本研究采用的理中汤加味方包括附子、干姜、党参、黄芪、白术、茯苓、五味子、山药、甘草等中药，方中附子、干姜为君药，党参、黄芪为臣药，白术、茯苓、五味子、山药共为佐药，甘草为使药，全方药材配伍具有温中补虚、温而不燥的特点，可健脾利湿、温阳散寒，适用于脾胃虚寒症诱发的口腔溃疡疾病。NF-κB信号通路是经典的炎症信号通路，有研究表明，NF-κB信号通路与ROU疾病的发生发展密切相关[18]。因此，本研究以NF-κB炎症通路为切入点，通过免疫法建立大鼠ROU模型，观察理中汤加味对大鼠ROU的修复作用，分析其对NF-κB炎症通路的影响。

结果显示，除正常组大鼠未出现口腔溃疡之外，其余大鼠均出现口腔溃疡。与模型组比较，阳性对照药物和不同剂量理中汤加味方可减轻大鼠口腔黏膜损伤和炎症浸润，减少大鼠口腔溃疡数量、持续时间和溃疡面积，延长间隔时间。与阳性对照组比较，除理中汤低剂量组外，高剂量和中剂量理中汤的效果优于阳性对照药物，表明不同剂量的理中汤加味方对大鼠ROU具有修复作用。ROU疾病的发生往往伴有炎症因子水平的升高，这是创面愈合的必经阶段，机体出现长时间炎症反应会影响创面血管新生和细胞的正常生长繁殖，并可能造成机体免疫功能发生障碍，对溃疡创面修复造成严重影响，出现“难愈性创面”，因此，降低机体炎症因子水平对ROU疾病是具有治疗作用的[19]。ELISA试剂盒检测结果显示，口腔溃疡模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子含量增加。而使用理中汤加味治疗后可降低大鼠血清中炎症因子含量。除理中汤低剂量组以外，理中汤高剂量组和中剂量组大鼠血清中炎症因子含量均低于阳性对照组，并呈剂量依赖性，表明理中汤加味方可降低ROU大鼠血清中炎症因子的水平。NF-κB信号通路是经典的炎症信号通路，其中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65在NF-κB炎症通路的激活中具有重要作用，可参与到溃疡性疾病的发生与发展过程[20-21]。Surboyo等[22]研究表明，降低NF-κB的表达对糖尿病相关口腔溃疡的愈合有较强的治疗作用。Xie等[23]研究证明，埃索美拉唑通过抗分泌、抑制NF-κB信号通路及抗氧化作用在应激性溃疡中发挥对胃的保护作用。与上述研究结果一致，在本研究中，ROU模型大鼠溃疡组织中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65等蛋白表达显著高于正常大鼠，使用理中汤加味治疗后，上述蛋白的表达水平则被显著降低。除理中汤低剂量组以外，理中汤高剂量组和中剂量组IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表达均低于阳性对照组，并呈剂量依赖性，表明理中汤加味方可抑制NF-κB信号通路在ROU疾病中的活化。

综上所述，理中汤加味方可以减少大鼠口腔溃疡的发病频率，缩短溃疡愈合时间，其机制可能是通过抑制NF-κB炎症通路发挥对口腔溃疡黏膜的修复作用。但ROU疾病的发病机制复杂，理中汤加味方是否通过其他途径发挥抗溃疡及黏膜修复作用仍需进一步深入探讨。