消朦灵方在糖尿病视网膜病变大鼠中的应用价值

冀 杰，罗艳华，孔 宁，林斌武

(1.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510000；2.广州市番禺中心医院，广东 广州 511400)

资料显示，全世界范围内糖尿病患者高达4.25亿人，国内糖尿病患者高达1.14亿人，随着糖尿病患者的增加糖尿病视网膜病变的发病率也急剧增加，该病会导致盲性眼病，给患者、家庭及社会带来了沉重的负担[1-2]。目前，治疗糖尿病视网膜病变的主要方法包括玻璃体切割术和激光光凝术，但上述治疗方法会损伤患者的视力，且给患者视力带来不适感，具有一定的局限性[3-4]。故研究有效的治疗糖尿病视网膜病变的药物尤为重要。中医药防治糖尿病视网膜病变已成为中医眼科领域研究的热点[5]，消朦灵方是临床常用于治疗视网膜病变的中药方剂，具有益气养阴、活血明目的功效，但其治疗糖尿病视网膜病变的具体机制尚不清楚。基于此，本研究将探讨消朦灵方在糖尿病大鼠视网膜病变中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：由动物实验中心提供的75只8周龄雄性SD大鼠，体重180～220 g，动物合格证号：0020829。饲养于动物实验中心，保持空气流通，温度为25～27 ℃，12 h光照维持，给予充足的饲料与水。本动物实验研究已经过动物实验伦理委员会批准。

1.1.2 药物及试剂：购自美国Slgma公司生产的链尿佐菌素；购自胱化学试剂厂生产的柠檬酸钠和柠檬酸；购自美国雅培公司生产的血糖试纸；购自北京中杉金桥公司生产的GAPDH内参；购自瑞士罗氏公司7600型全自动生化分析仪；购自江苏酶免公司生产的白细胞介素6(Interleukin 6，IL-6)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、白细胞介素1β(Interleukin 1β，1L-1β)及肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附法试剂盒；购自福州飞净生物科技公司生产的苏木素伊红试剂盒；消朦灵方组成：党参、瓦楞子、毛冬青各30 g，麦冬15 g，五味子5 g，田七3 g。由我院中药方提供。取上述药材后用4500 g水浸泡45 min，用武火煮沸，文火煮30 min，取药液备用；用1500 g水进行2次煎煮，20 min后与第一药液混合，浓缩，获得含生药量2 g/ml的溶液。

1.2 实验方法

1.2.1 造模：75只大鼠随机取15只为空白组，采用标准饲料喂养。剩余60只大鼠采用高脂饲料(66.5%标准饮食，2.5%胆固醇，1.0%胆汁酸，20%蔗糖，10%猪油)，1周后，对其空腹血糖进行测量，并称体重，建立糖尿病模型(采用一次性尾静脉注射链脲佐菌素50 mg/kg)。注射72 h后对大鼠空腹血糖进行测定，以大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L为高血糖大鼠，本研究中60只大鼠均造模成功。造模成功后继续高脂高糖饮食喂养1个月，至大鼠出现胰岛素抵抗、高血糖则为构建糖尿病大鼠模型成功。糖尿病大鼠造模成功后继续高脂高糖饮食喂养1个月，直至大鼠出现视网膜病变，则为糖尿病视网膜病变大鼠造模成功。糖尿病视网膜病变大鼠模型评价：随机取6只大鼠禁食1晚后，对空腹胰岛素、血糖及葡萄糖耐量进行检测，出现胰岛素抵抗，空腹血糖≥11.1 mmol/L，且行HE染色，大鼠视网膜发生视网膜病变，则为造模成功。

1.2.2 分组及给药方法：随机将60只糖尿病视网膜病变大鼠分为高剂量组、中剂量组、低剂量组及模型组，每组15只，各组根据人与动物表面积折算法按照6.8、3.4、1.7 mg/(kg·d)灌胃，空白组以0.9%氯化钠溶液灌胃，模型组以温开水灌胃，连续给药2个月。

1.3 实验指标

1.3.1 体重及血糖测量：每日7∶30测量大鼠体重及空腹血糖。

1.3.2 生化指标及IL-6、VEGF、1L-1β、TNF-α水平测定：取60 mg/kg戊巴比妥钠进行腹腔麻醉后，将完整眼球摘除，剪下角膜，分离晶状体、玻璃体，再将视网膜分离。取一半视网膜组织制成匀浆后离心，取上清液分成2份，1份采用全自动生化分析仪检测高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL-C)、甘油三酯(Triglycerides，TG)及总胆固醇(Total cholesterol，TC)；另一份采用酶联免疫吸附法对IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平进行测定。另一部保存于40 g/L甲醛溶液中备用。

1.3.3 检测细胞凋亡指数：冲洗、固定视网膜组织，石蜡包埋切片，洗脱后，冲洗，置于超纯水中，孵育15 min，洗涤2次(超纯水)。加入TUNEL反应液，黑暗孵育1 h，冲洗2次，封片。荧光显微镜下观察，细胞凋亡：发射波长535 nm、激发波长552 mm下显绿色荧光细胞。随机取8个视野计数，对凋亡指数进行计算后，各组取平均值。凋亡指数(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.3.4 视网膜组织血管生成素-1(Angiopoietin-1，Ang-1)、VEGF及血管内皮细胞生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)蛋白表达水平采用Western blot检测：取RIPA裂解液对视网膜组织进行裂解后提取总蛋白，蛋白浓度采用BCA蛋白浓度检测。经10% SDS-PAGE凝胶对每组50 μg蛋白上样量进行电泳分离，转膜，封闭，洗膜，孵育过夜，洗膜后，采用ECL化学发光发检测，拍照，内参为β-actin，借助Image J分析软件对各组的视网膜组织中的Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表达水平进行计算。

1.3.5 视网膜组织Ang-1、VEGF及VEGFR2表达水平采用qRT-PCR法检测：视网膜组织总RNA采用Trizol法提取，其水平采用酶标仪检测，逆转录总RNA得到cDNA，Ang-1、VEGF及VEGFR2表达水平均采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法检测。由上海生工公司设计合成的引物。Ang-1、VEGF及VEGFR2上游依次为5’-TAAATCAAACATCCCTCTT-3’、5’-CCTGGCTTACTGCTGTACCT-3’、5’-GCCGGCATGGTCTTCTGTGAG-3’；Ang-1、VEGF及VEGFR2下游依次为5’-AGGTGTCCAGCTCTTCCT-3’、5’-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3’、5’-GGGGCTCACGGACCACATCATCTAA-3’。反应条件：95 ℃预变性5 min及变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，连续40个循环，再次72 ℃延伸10 min。根据2-△△Ct法计算Ang-1、VEGF及VEGFR2表达量，上述样本量需检测3次。

2 结 果

2.1 各组体重和血糖比较 见表1。造模前，各组体重及血糖水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)；造模成功后第1天，高剂量组、中剂量组、低剂量组及模型组的体重低于空白组，血糖高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗后，各组体重比较，差异无统计学意义(P>0.05)；空白组、高剂量组血糖水平低于中剂量组、低剂量组及模型组，中剂量组血糖水平低于低剂量组及模型组，低剂量组血糖水平低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)；高剂量组血糖水平与空白组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组生化指标水平比较 见表2。治疗后，高剂量组、空白组HDL-C、LDL-C、TG及TC水平均低于中剂量组、低剂量组及模型组，中剂量组HDL-C、LDL-C、TG及TC水平低于低剂量组及模型组，低剂量组HDL-C、LDL-C、TG及TC水平均低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)；高剂量组HDL-C、LDL-C、TG及TC水平与空白组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

2.3 各组IL-6、1L-1β及TNF-α水平比较 见表3。治疗后，高剂量组、空白组IL-6、1L-1β及TNF-α水平均低于中剂量组、低剂量组及模型组，中剂量组IL-6、1L-1β及TNF-α水平低于低剂量组及模型组，低剂量组IL-6、1L-1β及TNF-α水平低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)；高剂量组IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平与空白组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表1 各组体重和血糖比较

表2 各组生化指标水平比较(mmol/L)

表3 各组IL-6、1L-1β及TNF-α水平比较(pg/ml)

2.4 各组Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表达水平比较 见表4。治疗后，高剂量组、空白组Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表达水平均低于中剂量组、低剂量组及模型组，中剂量组Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表达水平低于低剂量组及模型组，低剂量组Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表达水平低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)；高剂量组Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表达水平与空白组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

2.5 各组Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平比较 见表5。治疗后，高剂量组、空白组Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平均低于中剂量组、低剂量组及模型组，中剂量组Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平低于低剂量组及模型组，低剂量组Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量组Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平与空白组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 各组Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表达水平比较

表5 各组Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平比较

2.6 各组细胞凋亡情况比较 见表6(图1)。各组比较治疗后，高剂量组、空白组细胞凋亡指数均低于中剂量组、低剂量组及模型组，中剂量组细胞凋亡指数低于低剂量组及模型组，低剂量组细胞凋亡指数低于模型组，各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组细胞凋亡指数高于空白组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表6 各组细胞凋亡情况比较

图1 TUNEL染色法检测各组大鼠细胞凋亡(TUNEL染色，×400)

3 讨 论

在中医学中将糖尿病视网膜病变归属于“消渴目病”的范畴[6]，古籍可见《秘传证治要诀·三消》曰：“三清久之，精血既亏。或目无视，或手足偏废如风疾”。由此可得出该病之本为阴虚燥热、脾虚气弱，血瘀贯穿始终，属于本虚标实、虚实夹杂之证。故治则为益气养阴、化瘀通络。消朦灵方方中党参归脾、肺经，能够补中益气、健脾益肺，养血生津；瓦楞子归肺、胃、肝经，可补脾益气、滋咳润肺、缓急解毒、调和百药；毛冬青归肺、肝、大肠经，可清热解毒、活血通脉；麦冬归肺、心、胃经，可养阴润肺，益胃生津，清心除烦；五味子归肺、肾、心经，可敛肺滋肾、生津敛汗、涩精止泻、宁心安神；田七归肝、胃经，可化瘀止血、活血定痛。诸药合用共奏益气养阴、活血化瘀、通脉散结明目之功效。

李锦等[7]通过的研究指出，中药方剂联合针刺治疗非增殖性糖尿病视网膜病变有显著的疗效。程艳春等[8]的研究也指出，中药方剂能够降低单纯型糖尿病视网膜病变患者血糖水平，改善患者临床症状，效果显著。本研究结果显示，造模成功后第1天，高剂量组、中剂量组、低剂量组及模型组的体重低于空白组，血糖高于空白组；治疗后，空白组、高剂量组血糖及生化指标水平低于中剂量组、低剂量组及模型组，中剂量组血糖及生化指标水平低于低剂量组及模型组，低剂量组血糖及生化指标水平低于模型组，提示消朦灵方能够有效降低糖尿病大鼠视网膜病变血糖及生化指标水平，且与剂量密切相关。

IL-1β属于多效性细胞因子，对星形胶质细胞和小胶质细胞具有激活作用，致使糖尿病视网膜病变的神经炎性反应和进行性神经缘与血管变性[9]。TNF-α是重要的炎症因子之一，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，能够增加局部炎症反应，诱导血管内皮细胞释放凝血因子及启动凝血过程等作用。在增殖性糖尿病视网膜病变患者中的纤维血管膜浸润细胞、视网膜血管内皮细胞及细胞外基质中存在有大量的TNF-α，其能够诱导新血管生成。其水平越高表示糖尿病视网膜病变患者的预后不佳[10-11]。IL-6是一种多功能细胞因子，能够诱导血管内皮生长因子，促使其形成新的血管，导致血管渗透性增加，进而诱发糖尿病视网膜病变[12]。本研究结果显示，治疗后，高剂量组、空白组IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平均低于中剂量组、低剂量组及模型组，中剂量组IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平低于低剂量组及模型组，低剂量组IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平低于模型组，提示消朦灵方能够有效降低糖尿病大鼠视网膜病变大鼠IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平，降低炎症反应，可减少高血糖对视网膜的损害。

Ang-1是形成成熟血管所必需的，其与内皮特异性受体酪氨酸激酶2结合发挥作用，致使内皮细胞通透性降低，对VEGF具有调节作用，维持内皮细胞稳态。VEGF是糖尿病视网膜病变发生的重要因素，可使血管通透性增加，导致血-视网膜屏障功能破坏，致视网膜血管渗漏，且对视网膜内皮细胞的增殖及迁移具有刺激作用，诱发视网膜内形成新生血管，损害视功能[13]。在糖尿病视网膜病变中VEGF/VEGFR2发挥了重要作用，VEGF与VEGFR2的高亲和力结合并诱导VEGFR2的磷酸化而发挥促血管生成活性；对VEGF-VEGFR2及其下游ERK1/2和p38信号通路进行阻断，对视网膜内皮细胞血管具有抑制作用[14-15]。本研究结果显示，治疗后高剂量组、空白组Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表达水平均低于中剂量组、低剂量组及模型组，中剂量组Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表达水平均低于低剂量组及模型组，低剂量组Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表达水平低于模型组，提示消朦灵方能够有效降低糖尿病大鼠视网膜病变Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表达水平，改善糖尿病大鼠视网膜病变的严重程度，能够促使视网膜各层组织、毛细血管恢复。这可能是由于党参具有抗炎、抗氧化、调节糖脂代谢、免疫调节及抗肿瘤等作用[16]。毛冬青具有抗压、抗菌、抗血小板聚集、抗血栓、抗凝及对脑组织缺血、缺氧损伤的保护等多方面的作用[17]。麦冬具有降血糖、抗肿瘤、抗心肌缺血、免疫、抗氧化、抗过敏、保护外分泌腺等方面的药理作用[18]。五味子具有抗肿瘤、保护肝脏、降糖、延缓衰老、抗菌抑菌、增强骨骼肌、中枢调节、抗疲劳与耐缺氧、改善泌尿生殖与心血管系统、免疫调节等方面药理作用[19]。田七具有止血、抗血小板聚集、抗心律失常、保护脑组织、降血压、降血脂、抗炎、保肝、护肾、抗肿瘤、免疫调节等多方面的药理作用[20]。

本研究进一步分析了消朦灵方对糖尿病视网膜病变大鼠的细胞凋亡情况及视网膜组织光学显微镜下结构变化情况，结果显示，治疗后，高剂量组、空白组细胞凋亡指数均低于中剂量组、低剂量组及模型组，中剂量组细胞凋亡指数低于低剂量组及模型组，低剂量组细胞凋亡指数低于模型组；高剂量组细胞凋亡指数高于空白组，提示消朦灵方能够降低糖尿病大鼠视网膜病变细胞凋亡指数。

综上所述，消朦灵方能够有效降低糖尿病大鼠视网膜病变血糖水平，降低炎症水平，下调Ang-1、VEGF、VEGFR2水平，减少高血糖对视网膜的损害，降低细胞凋亡指数，促使视网膜各层组织、毛细血管恢复正常。