灯盏花素对非小细胞肺癌A549细胞的作用及机制研究

刘 婷，李 洋，石志红

(1.西安交通大学第一附属医院涉外病房，陕西 西安 710061；2.西安交通大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，陕西 西安 710061)

肺癌是高发病率与高死亡率的恶性肿瘤之一，被诊断为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者比例约占80%[1]。多数NSCLC患者被确诊时已经发展为NSCLC晚期，临床上所采用放化疗、免疫治疗或者靶向药物治疗，虽然能够让部分患者的生存时间延长，但是大部分患者预后仍旧不理想[2-3]。灯盏花别名地顶草或东菊，《云南中草药》中记载灯盏花甘、性温，具有散寒解表、止痛和舒筋等功效，可用于跌打损伤、疟疾、脑血栓形成、脑出血和风湿痛等疾病治疗[4]。灯盏花素(Breviscapine,BVP)是灯盏花的主要提取成分之一，在抗炎症反应、抗氧化应激、抑制血小板聚集以及调节机体微循环系统具有重要作用。既往研究[5-6]显示BVP在胃癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤表现出显著的抗肿瘤作用。也有学者提出BVP在肺癌中存在作用[7]，但是其中的具体作用机制尚不清楚。本文通过不同浓度BVP处理非小细胞肺癌A549细胞来探索BVPA549细胞的增殖及凋亡的影响，为临床治疗NSCLC方案选择提供试验参考意见。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料 仪器：CO2细胞培养箱(Heraeus)，96孔板、12孔板、6孔板(Thermo Fisher Scientific)，超低温冰箱(Thermo Scientific)，多功能酶标仪(Thermo Electron)、流式细胞仪(Becton Dikinson)，紫外分光光度计(让奇仪器科技有限公司)，切片机(莱卡)，高速离心机(Thermo)。试剂：BVP(南京药业有限公司)，兔抗人增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki67、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)、天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、p21抗体购于北京博奥森生物技术有限公司，二甲亚砜、MTT(Sigma)。材料：非小细胞肺癌A549细胞，购于上海一研究生物科技有限公司。

1.2 细胞培养及处理方法 将非小细胞肺癌A549细胞置于含有青霉素、链霉素各100 U/ml的完全培养基中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下静止培养。A549细胞生长至90%时则进行传代，制成细胞悬液。

1.3 MTT法检测细胞增殖情况 取对数生长期的非小细胞肺癌A549细胞于超净台中制成2×104/ml的细胞悬液，接种在96孔板中，200 μl/孔，37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h后，将A549细胞分为对照组、BVP低剂量组(20 μmol/L)、BVP中剂量组(40 μmol/L)、BVP高剂量组(80 μmol/L)，每组6个重复孔，低剂量组、中剂量组、高剂量组均加入BVP，并使其最终浓度分别为20、40、80 μmol/L，对照组加入等剂量的DMSO。各组细胞在培养12、24、48 h后弃培养液，加20 μl的MTT溶液，培养2 h，弃MTT溶液，加入150 μl DMSO，采用酶标仪在490 nm波长处检测吸光度值，细胞存活率=处理组OD值/对照组OD值×100%。

1.4 细胞凋亡检测 取1.3中BVP处理24 h细胞，1000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，然后加入300 μl缓冲液重悬细胞，加入5 μl Annexin V/FITC、10 μl PI混合均匀，室温避光孵育15 min，上样流式细胞仪。

1.5 Western-blot检测 提取各1.3中BVP处理24 h细胞总蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至PVDF膜，密封1 h，加入Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Ki67、PCNA、CyclinD1、p21一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，采用TBST漂洗PVDF膜40 min，加入HRP标记的二抗(1∶500)孵育1.5 h，参照ECL试剂盒操作说明进行显影与定影，观察膜上蛋白条带，收集影像。

2 结 果

2.1 灯盏花素对A549细胞增殖的影响 见表1。在处理时间相同时，A549细胞存活率随着BVP浓度的增加而降低；在相同BVP浓度处理下，A549细胞存活率随着BVP作用时间的延长而降低(P<0.05)。

表1 各组细胞存活率比较(%)

2.2 灯盏花素对细胞增殖相关蛋白水平的影响 见表2。BVP低剂量组、BVP中剂量组和BVP高剂量组细胞的Ki67、PCNA、Cyclin D1蛋白表达量低于对照组(P<0.05)，p21表达量高于对照组(P<0.05)，存在剂量效应(P<0.05)。

表2 各组细胞增殖相关蛋白水平比较

2.3 灯盏花素对A549细胞凋亡的影响 见表3。BVP低剂量组、BVP中剂量组和BVP高剂量组细胞的凋亡率均高于对照组(P<0.05)，存在剂量效应(P<0.05)；BVP低剂量组、BVP中剂量组和BVP高剂量组Bax、Caspase-9与Caspase-3蛋白水平高于对照组(P<0.05)，而Bcl-2蛋白水平低于对照组(P<0.05)，存在剂量效应。

表3 各组细胞凋亡率及相关蛋白水平比较

3 讨 论

非小细胞肺癌属于一种肺部恶性肿瘤性疾病，发病起源于支气管黏膜、支气管腺体和肺泡上皮，显微镜下核异形、细胞变大和胞浆丰富等特点[8]。我国非小细胞肺癌病例占据肺癌四成以上，早发现、早诊断和早治疗对提高肺癌患者的治愈率及5年生存率至关重要。目前非小细胞肺癌主要治疗方式有手术、化疗、放疗、局部介入治疗、分子靶向治疗以及中医中药治疗等[9]，虽然放化疗方式可以使部分患者病情得到改善，但是长期化疗、放疗对患者机体仍可产生不可忽视的不良反应，不利于患者自身免疫力提高，并可能逐渐出现肿瘤耐药。中医中药在恶性肿瘤治疗过程的不良反应少的优势已逐渐受到大众认可[10]，BVP是灯盏花中的黄酮类成分，其包括灯盏甲素与灯盏乙素，临床上主要将BVP用于治疗高血压、脑血管缺血、心血管等疾病并且临床疗效较好。此外，动物体内体外实验研究显示BVP具有心血管药物的作用，例如抗血小板聚集、抗凝血、抗血栓形成、增强机体清除自由基能力以及改善机体微循环的作用。近年研究显示BVP在肿瘤生长与肿瘤细胞的生物学行为方面具有一定的抑制作用。Ke等[11]研究报道显示，BVP能够降低肝癌细胞的侵袭与迁移能力，主要是通过抑制STAT3/AKT信号通路实现的。

本研究结果显示，BVP能够降低A549细胞的存活率且存在剂量效应，采取Western-blot检测与细胞增殖相关蛋白表达水平，结果显示BVP能够降低A549细胞中的Ki67、PCNA、Cyclin D1蛋白含量，并且增加p21蛋白水平。Cyclin D1能够与细胞周期依赖性激酶(CDK)结合参与细胞周期，其可以在G1期迅速合成，在进入S期时开始降解[12]。PCNA是一种促进DNA延伸的核蛋白，在真核生物细胞中的DNA复制具有重要作用[13]。Ki-67是一种增殖细胞核抗原，能够反映细胞增殖情况，当细胞进入S期时其蛋白含量增加[14-15]。在细胞增殖的过程中除了周期蛋白、增殖细胞核抗原的参与，还存在一类细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)参与细胞增殖过程。CKI能够与CDK结合并抑制CDK活性，来保证细胞周期的高度时序性，因此CKI在细胞增殖、细胞周期中起着负调控作用。p21是CKI家族成员之一，它能与PNCA结合来实现对DNA合成的抑制作用[16]。Guan等[17]研究结果显示BVP可以诱导前列腺癌细胞的DNA损伤，进而实现对肿瘤细胞的生长的抑制作用与促进肿瘤细胞的凋亡作用。本研究结果与前人结果的趋势相似，提示BVP可能是通过增加p21蛋白水平，使p21与PNCA结合增加而抑制DNA合成；同时还可能增加CKI与CDK结合，抑制CDK的活性以致Cyclin D1/CDK结合受到影响，不能使A549细胞快速从G1期到S期的转换，从而降低Ki-67蛋白含量，阻滞了A549细胞周期，延缓了细胞分裂进程，最终影响到非小细胞肺癌A549细胞的增殖。

细胞凋亡在细胞的生物学进程中具有重要意义，细胞存活率的降低不仅细胞增殖能力降低，还存在细胞凋亡率增加的可能。本研究结果显示BVP能够增加非小细胞肺癌A549细胞的细胞凋亡率，同时与细胞凋亡相关蛋白的Western-blot检测显示Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量增加，而Bcl-2蛋白水平降低。Bax是促凋亡基因，而Bcl-2是抗凋亡基因，Bax、Bcl-2拮抗调控细胞凋亡，Bax、Bcl-2比例情况决定着细胞凋亡状态[18-20]。Caspase-3是各种凋亡途径的靶蛋白，凋亡途径中的信号被激活后，会促使Caspase蛋白家族表达水平发生改变，经Caspase-3蛋白诱导细胞凋亡[21]。Bax是线粒体膜的成分之一，其含量增加能够使Cyt-C穿过线粒体膜进入细胞基质，激活细胞凋亡程序起始的Caspase-9，进而激活Caspase-3，促使细胞凋亡[22]。孙蕾等[23]研究显示BVP可以通过上调Bax表达，下调Bcl-2表达来增加A549细胞凋亡。本研究结果与前人研究相似，表明BVP可能是通过增加Bax蛋白水平，降低Bcl-2蛋白含量，激活Caspase-9、Caspase-3活性，进而促进A549细胞凋亡。

综上所述，BVP可以通过上调p21蛋白表达量，下调PNCA、CyclinD1、Ki-67蛋白含量，阻滞细胞周期，从而使细胞增殖受到抑制；BVP可以通过增加Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白水平，降低Bcl-2含量，从而促进A549细胞凋亡。但是BVP是通过何种途径调节非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡的详细机制还需要更深层次研究。