逍遥散联合维生素D对产后抑郁大鼠行为学及脑组织形态学的影响

郑 舒，何 津，单延红

(吉林大学第一医院产科，吉林 长春 130021)

产后抑郁症(Postpartum depression，PPD)是一种常见的妇科产后疾病。调查显示，西方国家的分娩产妇产后PPD病发率在15%左右[1]。而我国产后患者PPD的发病率在20%左右[2]。其临床主要以烦躁、沮丧、悲伤、易激怒以及抑郁等。大部分患者会在经历5个月左右的病程后恢复，也有60%左右的PPD患者恢复时间长至1年[3]。PPD不仅仅会对患者婚姻、家庭以及产妇身体健康产生影响，严重者还可对孩子的健康成长产生影响[4]。目前临床上通常采用西医进行治疗，包含有心理疗法、激素补充治疗、精神药物治疗等，主要以药物结合心理疗法综合治疗[5]。但由于长期服用抗抑郁或者激素类药物具有一定的不良反应，而产妇需要抚育和哺乳婴儿，故部分PPD患者不愿意进行西医治疗[6]。有关研究显示，逍遥散是一种可以调冶人体情志活动的中医经典名方，对于产后抑郁具有较好的疗效，但具体的临床作用机制尚未明确[7]。故本文探讨逍遥散联合维生素D对产后抑郁大鼠行为学及脑组织形态学的影响，为产后抑郁的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性SD大鼠，体重(198.25±8.54)g，月龄2～4个月，购于南京卡文斯生物技术有限公司。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器：大鼠强迫游泳水缸(圆筒状，水深35 cm、高度60 cm、直径25 cm)；Digital Sight DS-U2图像采集系统，购于日本尼康公司；倒置式生物显微镜(CKX41S)，购于日本奥林巴斯公司；旋转石蜡切片机(Finesse325型)，赛默飞世尔仪器有限公司。

1.2.2 试剂：黄体酮注射液(国药准字H33020828)；苯甲酸雌二醇注射液(国药准字H44022008)；维生素D(国药准字H20113033)；逍遥散处方为薄荷、炙甘草各40 g，生姜60 g， 茯苓、 白术、白芍、当归、柴胡各100 g。7680 ml水煎煮2次，每次1 h，合并煎液，旋蒸煎液浓缩，并经过喷雾干燥处理，得干粉171.5 g，临床使用时将其按照1 g/ml配成干粉0.9%氯化钠溶液。

1.3 实验方法

1.3.1 PPD造模方法[8]：对大鼠按照1.5 ml/kg的2%戊巴比妥钠剂量进行腹腔注射麻醉，无菌条件下，子宫结扎并将两侧的卵巢切除，为预防感染，可在窗口喷涂庆大霉素。术后2 d进行阴道涂片，观察大鼠的动情周期改变，动情前期、中期和后期显微镜下可见白细胞或者角化细胞；非发情期显微镜下可见少量的上皮细胞。显微镜结果显示白细胞或者角化细胞，表明卵巢未完全切除，去除。

1.3.2 分组及给药方法：去除建模不合格的15只大鼠，将其随机分为空白组、模型组、维生素D组、联合组四组，各50只。每组选定治疗后1、2、4、6周为观察点，每个观察点设定大鼠10只。空白组大鼠给予0.5 ml/d 的芝麻油皮下注射，连续治疗16 d，之后0.1 ml/d 的芝麻油皮下注射，连续治疗7 d。模型组、维生素D组以及联合组大鼠给予4 mg注射用黄体酮和0.1 mg苯甲酸雌二醇进行治疗，连续治疗16 d，之后0.2 mg/d的苯甲酸雌二醇皮下注射治疗，从而对怀孕状态进行模拟。第24天，对照组和模型组分别给予相应容量的0.9%氯化钠灌胃处理；维生素D组给予0.2 μg/(kg·d)的维生素D灌胃给药；联合组在维生素D组的基础上外加20 ml/(kg·d)的逍遥散汤剂灌胃给药。四组大鼠产后均给药处理30 d。

1.4 观察指标

1.4.1 糖水消耗[9]：禁水处理24 h，之后让各组大鼠进行1%蔗糖水自由饮用1 h，对蔗糖水消耗量进行计算。

1.4.2 旷场实验(OFT)[10]：垂直活动得分为大鼠直立的次数，水平活动得分为动物穿越方格的数量为准。每次测定之前将敞箱内保持整洁，5 min/次，对每只大鼠的垂直活动和水平活动得分进行记录。

1.4.3 强迫游泳实验(FST)[11]：每只大鼠在水温24～25 ℃条件下进行预游泳，擦干，28 ℃ 30 min后，置于笼中。1 d后进行正式的FST试验，记录大鼠在5 min之内，不动状态的时间总和。

1.4.4 神经递质水平：最后给药结束1 d后，断头处理，冰浴条件下对双侧海马进行剥离，清洗后，称重，液氮保存。取10大鼠样本，采用酶联免疫吸附法对大鼠海马组织中多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)神经递质的水平，试剂盒购于上海江莱生物，操作方法严格按照说明书执行。

1.4.5 脑组织病理形态观察：每组10只大鼠，在1、2、4、6周时间点对其脑组织形态学进行观察。大鼠断头处理，立即取出脑，将其置于相同灌注液的瓶中进行2周时间的固定，常规脱水、石蜡包埋、切片处理。常规HE染色后，在光学显微镜下对大鼠脑组织形态学进行观察。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.00统计学软件对上述资料进行整理分析，其中计量资料采用正态性检验，行t检验，多组组间比较行单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠各时点蔗糖水消耗量 空白组、维生素D组和联合组大鼠蔗糖水消耗量呈现上升趋势，模型组逐渐下降。与空白组相比，相同时间点，模型组、维生素D组和联合组的蔗糖水消耗量均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，联合组、维生素D组第2、4、6周的蔗糖水消耗量明显升高，且联合组大鼠升高更为显著(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠各时点蔗糖水消耗量(g)

2.2 各组大鼠各时点OFT水平得分 空白组、维生素D组和联合组大鼠OFT水平得分呈现上升趋势，模型组逐渐下降。与空白组相比，相同时间点，模型组、维生素D组和联合组的OFT水平得分均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，联合组、维生素D组第2、4、6周的OFT水平得分明显升高，且联合组大鼠升高更为显著(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠各时点OFT水平得分(分)

2.3 各组大鼠各时点OFT垂直得分 空白组、维生素D组和联合组大鼠OFT垂直得分呈现上升趋势，模型组逐渐下降。与空白组相比，相同时间点，模型组、维生素D组和联合组的OFT垂直得分均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，联合组、维生素D组第2、4、6周的OFT垂直得分明显升高，且联合组大鼠升高更为显著(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠各时点OFT垂直得分(分)

2.4 各组大鼠各时点FST 不动时间 空白组、维生素D组和联合组大鼠FST 不动时间呈现下降趋势，模型组逐渐上升。与空白组相比，相同时间点，模型组、维生素D组和联合组的FST 不动时间均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，联合组、维生素D组第2、4、6周的FST 不动时间明显降低，且联合组大鼠升高更为显著(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠各时点FST 不动时间(s)

2.5 各组大鼠治疗完成后海马中5-HT、NE、DA含量变化 与空白组相比，模型组、维生素D组及联合组大鼠海马组织中5-HT、NE、DA含量均明显较低(P<0.05)。与模型组相比，维生素D组及联合组大鼠海马组织中5-HT、NE、DA含量均明显升高，且联合组升高更为显著(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠治疗完成后海马中5-HT、NE、DA含量变化(nmol/L)

2.6 各组大鼠脑组织形态学观察 经HE染色，切片观察显示，空白组大鼠的海马CA2区细胞密度大，数量多，细胞层排列较为紧密整齐，核仁清晰可见，胞浆饱满，细胞结构完整。模型组大鼠在第6周时，呈现一定程度的损伤，细胞间隙变大，数量减少，细胞稀疏紊乱，细胞层变薄，结构也相对不完整，且多数呈现一定萎缩状态，部分细胞呈现空泡化，细胞核变小，或可见细胞核碎裂、肿胀、淡染，严重者可呈现嗜酸性染色。维生素D组第6周时，细胞核以及其他细胞结构有一定改善，空泡化和核固缩现象减少，核仁清晰，细胞膜相对较为完整。联合组大鼠在第6周时，细胞数量明显增加，核固缩及细胞空泡化明显改善，排列基本整齐，病理形态恢复状态与空白组相似，但与正常状态仍有一定差异(图1)。

图1 各组大鼠治疗第6周时脑组织病理形态(HE染色，×200)

3 讨 论

PPD是一种复杂情绪障碍型的抑郁症，但由于其发病的病理复杂性和生理特殊性，致使本病的模型建设方面与传统意义上的抑郁症存在一定的差异[12]。目前，临床上大都公认激素模拟妊娠(HSP)后激素停撤实验是PPD模型的建立方法，国内外研究较为广泛。其在一定程度上满足了动物模型的基本要求，即行为表现的模拟性；理论基础的合理性；药物治疗的有效性；反映人体病理生理学和生物学性状改变，与人类PPD疾病具有相似性[13-14]。本文通过PPD大鼠模型的建立，为临床试验提供平台，以期对PPD发病病机病因进行探讨。目前，多项临床研究显示，PPD患者大都存在一定程度的脑内神经递质含量降低的，受体敏感性降低的现象，递质系统失衡[15-16]。而海马是大脑的一个重要组织系统，也是一个易受损且对应激反应较为敏感的结构区域。海马脑区含有丰富的神经递质和各种激素，用于调节机体的行为、记忆和学习以及情绪等[17]。大鼠海马组织内的相关神经递质水平与PPD的发病机制关系密切。DA是一种独立性的神经递质，也是NE的前体。DA除了可以通过神经元对躯体运动进行调节外，还可调节推理、理解、思维、认知以及情感等精神活动，DA的失活会一定程度造成抑郁症的发生[18]。NE和5-HT主要调节性功能、食欲、记忆、警觉、睡眠以及情感，是与人类行为关系密切的神经递质[19]。文中结果显示，逍遥散治疗的联合组大鼠海马组织DA、NE、5-HT含量明显升高，说明了逍遥散可以明显改善PPD大鼠的海马组织的神经递质水平。这可能主要是由于逍遥散是一种含有茯苓、柴胡、白芍等8味中药的复方，作用靶点较多，其中柴胡可以明显升高肝郁证大鼠的脑内DA和NE水平，茯苓可以诱导5-HT的合成分泌，进而对PPD大鼠的海马组织神经递质水平进行调节[20]。

文中行为学研究结果说明了正常大鼠由于具有较为明显的蔗糖水饮用快感，消耗量相对较大；FST不动时间则较短；PFT垂直和水平活动得分相对较高。而模型组大鼠蔗糖水消耗量呈现降低趋势；FST不动时间明显延长；OFT垂直和水平活动得分显著降低。而经过逍遥散治疗的联合组大鼠各个方面的行为学指标改善显著，尤其是在第4周和第6周时，行为学的回复状态更为接近大鼠的正常水平。海马组织结构出现损伤时，会引起机体相关内分泌调节因子以及相关神经递质的变化，进而诱导抑郁症的产生，与文中海马组织DA、NE、5-HT含量变化结果相符。另外相关研究表明，PPD模型大鼠海马组织出现较多的胞核脱失，神经元细胞排列紊乱，数目明显减少，胞核碎裂、肿胀，甚至出现核固缩。文中结果表明，正常大鼠海马组织细胞核仁清晰，胞浆饱满，细胞数量多，排列整齐且结构完整；而模型大鼠细胞核缩小，呈现萎缩，有的细胞有核固缩出现，而经过逍遥散治疗后，尤其是在第4周和第6周时，大鼠脑组织形态学恢复较好。这可能是由于逍遥散通过改善海马组织中相关神经递质的调节，对其行为学和脑组织形态学进行改善。

综上所述，逍遥散联合维生素D可显著改善产后抑郁大鼠的各项行为学指标，提高海马组织神经递质的含量，对脑组织损伤具有一定恢复效果，具有较高的临床参考价值。