沙葱萤叶甲核糖体蛋白基因GdRpS3a的克隆、分子特性及表达分析

马红悦，李 玲，乌亚汗，田 羽，李艳艳，庞保平*

(1.内蒙古农业大学草原昆虫研究中心, 呼和浩特 010020; 2.内蒙古镶黄旗草原工作站, 内蒙古镶黄旗 013250)

核糖体蛋白S3a(RpS3a)是一种核糖体小亚基蛋白，除参与蛋白质合成外，还有许多生理功能，如细胞凋亡(Naoraetal., 1998)、细胞转化(Lecomteetal., 1997)、卵子形成(Reynaudetal., 1997；Zuritaetal., 1997)、信号传导(Norihisaetal., 2002)及免疫功能(Huetal., 2000)等。目前，从高等的哺乳动物到低等的细菌，已有许多物种的S3a基因被成功解析，并且S3a蛋白的一些核糖体外的功能也得到了证实(朱保健等，2010)。然而，目前昆虫核糖体蛋白的研究较少，且主要集中于模式昆虫-黑腹果蝇Drosophilamelanogaster(Schmidtetal., 1996; Reynaudetal., 1997; van Beestetal., 1998; 李艳红, 2014)、经济昆虫-家蚕Bombyxmori(Yang and Sehnal, 1998)、柞蚕Antheraeapernyi(朱保建等, 2010)和卫生害虫-尖音库蚊Culexpipiens(Robichetal., 2007; Heetal., 2009; Kimetal., 2010; Kim and Denlinger, 2010)、埃及伊蚊Aedesaegyptt(Mazzacano and Fallon, 1996; Niu and Fallon, 2000)、家蝇Muscadomestica(胡亚等, 2016)及麻蝇Sarcophagacrassipalpis(Craiq and Denlinger, 2000)等，对农业害虫核糖体蛋白的研究仅限于对几种主要害虫核糖体蛋白基因的克隆及表达谱分析，如烟草天蛾Manducasexta(Song and Gilbert, 1997)、地中海实蝇Ceratitiscapitate(Gagouetal., 2000; Verrasetal., 2004)、菜蛾(Wangetal., 2005)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(潘湛清等, 2008)、粘虫Mythimnaseparata(李柯等, 2010; 李柯, 2012)、褐飞虱Nilaparvatalugens(朱家俊等, 2016; Zhuetal., 2017)及松墨天牛Monochamusalternatus(罗淋淋等, 2016)等。

滞育是昆虫为躲避不利的环境条件而暂时停止发育的季节性适应策略，在昆虫生命活动中起着重要作用。然而，核糖体蛋白在昆虫滞育中的作用却很少了解。Robich等(2007)首次发现RpS3a在尖音库蚊滞育初期显著下调。Kim等(2010)进一步证实，RpS3a在非滞育雌成虫中持续表达，而在滞育初期(成虫羽化后7～10 d)急剧下调，应用RNAi沉默RpS3a可使非滞育雌虫卵泡停止发育，但沉默效应只有10 d，RNAi短暂的RpS3a抑制不能持续地阻止卵巢发育，并且外用保幼激素可抵消RpS3a的干扰效应。卵巢发育停止是成虫滞育的主要特征(Kimetal., 2010)，上述研究表明核糖体蛋白可能在昆虫成虫滞育中起着重要作用。

沙葱萤叶甲Galerucadaurica(Joannis)属鞘翅目Coleoptera叶甲科Chrysomelidae萤叶甲亚科Galerucinae，是近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的新害虫，主要啃食沙葱Alliummongolium、多根葱A.polyrhizum、野韭A.ramosum等百合科葱属牧草(昊翔等, 2015)。沙葱萤叶甲一年发生一代，以卵滞育越冬(高靖淳等, 2015; Zhouetal., 2016)，幼虫最早于4月上中旬开始出现，夏季成虫羽化取食约7～10 d后停止取食活动，聚集于草丛、牛粪及石块下滞育越夏，为专性滞育；成虫羽化约80～90 d后滞育解除，开始取食、交配及产卵(陈龙等, 2018a；Maetal., 2019)。目前对沙葱萤叶甲成虫夏滞育及其机理的了解还很少，主要集中在不同滞育阶段体内糖类、蛋白、脂肪含量(陈龙等, 2018a)及海藻糖酶(陈龙等, 2018b)和热激蛋白(陈龙等, 2019)基因表达量的变化。本研究前期应用蛋白组学技术分析了沙葱萤叶甲成虫夏滞育不同阶段蛋白组成的变化，结果发现多个核糖体蛋白差异表达(Maetal., 2019)。因此，本试验拟克隆沙葱萤叶甲RpS3a基因，分析其在沙葱萤叶甲不同发育阶段及不同温度胁迫下的表达特性，以期为进一步揭示RpS3a在沙葱萤叶甲生长发育及其夏滞育中的调控作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验所用的供试沙葱萤叶甲越冬卵于2019年 4月采自内蒙古锡林郭勒盟镶黄旗草原。将越冬卵置于温度25℃±1℃、相对湿度70%±5%、光周期为14 L∶10 D的PRX-350C智能型人工气候箱(宁波海曙赛福实验仪器厂)中孵育，幼虫孵化后以沙葱饲养。期间收集：(1)发育阶段：卵、幼虫1～3龄、预蛹、蛹、成虫羽化3、7、10、15、25、40、60、80和100 d。每组3个生物学重复，每个生物学重复：卵50粒，1～3龄幼虫各5～10头，预蛹和蛹各5头，成虫4头(♀∶♂=2∶2)。(2)温度处理：选择羽化3 d的成虫，分别在0、5、10、15、20、25、30、35及40℃处理1 h，每组3个重复，每个重复雌雄各2头。用液氮迅速冷冻后置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time), SMARTer©RACE 5′/3′ Kit User Manual, TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD19-T Vector Cloing Kit, DNA 2000 Marker等均购自大连TaKaRa有限公司；PGEM-T Easy载体，T7 RiboMAXTM Express RNAi System试剂盒，GoTaq©qPCR Master Mix(2×), T4 DNA连接酶等均购自美国Promega公司；Taq PCR Master Mix(2×, blue dye)购自上海生工有限公司；感受态细胞DH5α购自Tiangen生化科技有限公司。

1.3 总RNA提取和反转录

将1.1节中超低温冻存的样品分别用液氮研磨，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒提取总RNA，使用分光光度计(NanoPhotometerTMP-Class)和1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度及完整性。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书操作，反转录获得cDNA第1链，并置于-20℃保存备用。

1.4 沙葱萤叶甲RpS3a中间片段的克隆

根据本实验室建立的沙葱萤叶甲转录组数据，筛选注释为沙葱萤叶甲RpS3a的基因序列，并通过NCBI网站序列进行比对鉴定。利用Primer Premier 5.0软件设计引物RpS3a-F和RpS3a-R(表1)，引物由上海生工生物有限公司合成。反应体系(25 μL): PCR Master Mix 12.5 μL, 上/下游引物(0.2 μmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL(100 ng/μL)和RNase-free Water 9.5 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min; 94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min, 30个循环; 72℃延伸10 min，4℃保存。PCR反应结束后，将产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的DNA片段纯化、回收后连接pMD©19-T载体并且转化至感受态细胞DH5α，吸取200 μL菌液涂平板，在37℃下倒置过夜培养12～16 h，待菌落长出后，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆菌落并PCR验证后，送至北京六合华大基因有限公司测序。

1.5 沙葱萤叶甲RpS3a的3′端序列和5′端序列克隆

以沙葱萤叶甲成虫羽化3 d的RNA为模板，利用SMARTer©RACE 5′/3′ Kit User Manual试剂盒合成5′-RACE-Ready cDNA和3′-RACE-Ready cDNA。根据测序验证后的中间片段，分别设计5′/3′特异性引物(gene-specific primer, GSP)和嵌套基因特异性引物(nested gene-specific primer, NGSP)(表1)。分别用试剂盒中自带的10×Universal Primer A Mix(UPM)引物和特异性引物GSP配对进行Touchdown PCR。反应体系共50 μL：5′-or 3′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，10×UPM 5 μL，5′ or 3′ GSP(10 μmol/L)1 μL，Master Mix 41.5 μL。反应程序：94℃ 30 s变性，70℃ 3 min延伸，5个循环；94℃ 30 s变性，70℃ 30 s退火，72℃ 3 min延伸，5个循环；94℃ 30 s变性，68℃ 30 s退火，72℃ 3 min延伸，25个循环。用Tricine-EDTA稀释Touchdown PCR反应产物15倍为模板，以试剂盒自带short引物和NGSP为配对进行巢式PCR反应，反应体系同1.4节，反应程序：90℃ 5 min预变性，90℃ 30 s变性，68℃ 30 s退火，72℃ 3 min延伸，30个循环。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，纯化回收目的片段、连接载体、转化、测序等同1.4。

表1 引物信息

1.6 生物信息学分析

利用NCBI ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测沙葱萤叶甲RpS3a的开放阅读框，采用NCBI中的BlastP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和DNAMAN 6.0(Lynnon Biosoft，加拿大)进行同源性分析及序列比对，使用在线软件SignalIP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测沙葱萤叶甲RpS3a的信号肽序列，运用DNAMAN 6.0软件(Lynnon Biosoft，加拿大)进行分子量和等电点的预测，蛋白跨膜区分析采用TMHMM在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，用Phylosuite软件构建系统发育树(贝叶斯法MrBayes)，1 000次抽样分析(Zhangetal., 2020)。

1.7 沙葱萤叶甲RpS3a的表达谱分析

利用荧光定量技术(qPCR)检测RpS3a在沙葱萤叶甲不同发育时期以及不同温度下的相对表达量。定量实验在FTC-3000实时荧光定量PCR仪(Funglyn Biotech, 加拿大)上进行。qPCR特异性引物为qRpS3a-F/qPRS3a-R，内参为SDHA(Tanetal., 2017)，反应体系(20 μL): cDNA模板2 μL, qRpS3a-F和qRpS3a-R引物(10 μmol/L)各0.4 μL, GoTaq©qPCR Master Mix 10 μL, ddH2O 7.2 μL。反应程序：95℃预变性3 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环；95℃ 15 s，65℃ 15 s，95℃ 15 s。每个处理3个生物学重复，进行4次技术重复，采用2-ΔΔCt方法进行定量分析(Livak and Schmittgen, 2001)。

1.8 数据分析

利用SPSS 20.0进行单因素方差分析，Duncan法进行多重比较，数据结果用平均值±标准误(SE)表示，显著水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 沙葱萤叶甲RpS3a的cDNA全长克隆及序列分析

根据沙葱萤叶甲转录组数据，筛选注释为沙葱萤叶甲RpS3a的基因序列，设计引物进行中间片段的PCR扩增，获得目的片段的大小为690 bp，所得测序结果与转录组数据库中的序列信息完全一致。在3′和5′ RACE中分别获得350 bp和170 bp两个片段，通过序列拼接及测序验证得到RpS3a的cDNA全长序列，命名为GdRpS3a(GenBank登录号为：MN660144)。GdRpS3a的全长为800 bp，开放阅读框(open-reading frame, ORF)为687 bp，共编码228个氨基酸，5′非编码区(untranslated region, UTR)长度为58 bp，3′ UTR长度为55 bp；具有核糖体蛋白S3a家族的保守功能域。推测的编码蛋白分子量为25.63 kDa，预测等电点(pI)为10.53。SignalIP 4.1 Server预测结果显示该蛋白无信号肽。TMHMM在线软件分析蛋白质跨膜区域结果表明，GdRpS3a不含跨膜结构。

2.2 GdRpS3a的同源序列对比及系统进化分析

利用NCBI Blast同源性搜索，得到其它8个同为鞘翅目物种的RpS3a序列，利用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对。结果显示，沙葱萤叶甲RpS3a的氨基酸序列与同一亚科的玉米根萤叶甲DiabroticavirgiferavirgiferaRpS3a的一致性最高，为54.10%；其次是马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata和光肩星天牛Anoplophoraglabripennis，同为52.99%。此外，白杨叶甲Chrysomelatremula、小蜂窝甲虫Aethinatumida、米象Sitophilusoryzae、山松大小蠹Dendroctonusponderosae、赤拟谷盗Triboliumcastaneum的氨基酸一致性分别为49.44%、49.25%、43.98%、42.32%和41.20%(图1)。

图1 沙葱萤叶甲与其它昆虫RpS3a的氨基酸序列比对

所建立的系统发育树表明(图2)：沙葱萤叶甲RpS3a与玉米根萤叶甲的RpS3a亲缘关系最近，首先聚为一分支，置信度为83%；然后与同为叶甲科的马铃薯甲虫聚在一起，再与白杨叶甲聚为一大分支，在一定程度上反应其亲缘关系。

图2 基于氨基酸序列构建沙葱萤叶甲与其它昆虫RpS3a的系统发育树

2.3 沙葱萤叶甲RpS3a在不同发育阶段的表达模式

RpS3a在沙葱萤叶甲的不同发育阶段均有表达，且存在显著差异(P<0.05)。成虫滞育结束后(80 d和100 d)表达量最高，其次60日龄成虫、幼虫、预蛹和蛹，最低为卵和3～40日龄成虫(图3)。

图3 GdRpS3a在沙葱萤叶甲不同发育阶段的表达水平

2.4 不同温度下沙葱萤叶甲RpS3a的表达模式

沙葱萤叶甲成虫经不同温度处理1 h后，GdRpS3a的相对表达量存在显著差异(P<0.05)，其中30℃下表达量最高，约为常温对照25℃的10倍；其次为15℃，约为对照的6倍；最低为0℃和25℃；其它温度处理间表达量差异不显著(P>0.05)(图4)。

图4 沙葱萤叶甲GdRpS3a在不同温度下的表达水平

3 结论与讨论

核糖体蛋白在生物体内普遍存在且种类繁多，参与一系列的生命过程，包括细胞凋亡、调控转录、恶性转化及免疫应答等细胞功能(Warner and Mclntosh, 2009)。核糖体蛋白S3a存在于40S的核糖体亚基上，在蛋白质翻译过程中起着重要作用，是生命体中蛋白质合成和细胞代谢的重要调控因子(Shemeretal., 2000)。本研究通过RACE技术，首次从沙葱萤叶甲中成功克隆了RpS3a的cDNA全长序列。系统发育分析表明，沙葱萤叶甲RpS3a与玉米根萤叶甲RpS3a的亲缘关系上最近，二者同属于鞘翅目叶甲科萤叶甲亚科。该基因编码的氨基酸序列与玉米根萤叶甲、马铃薯甲虫等物种的RpS3a序列进行比对，存在一个RpS3a蛋白家族的保守功能域。因此，本研究所克隆的基因属于核糖体蛋白S3a家族中的一员。

核糖体蛋白主要作用是参与蛋白质的合成，但许多核糖体蛋白还具有次要功能(Wool, 1996)。RpS3a在果蝇Drosophilidae的整个发育过程中均有表达(van Beestetal., 1998)，特别是在胚胎发育过程和卵巢发育的雌成虫中高表达，是卵子形成必需的(Reynaudetal., 1997)。随后在其他昆虫中的研究中也获得了类似的结果，如：地中海实蝇CcRpS21在胚胎和幼虫中的表达量高于蛹和成虫，且雌成虫高于雄成虫(Verrasetal., 2004)；一种摇蚊Chironomusriparius的RpL11、RpL13、RpS3和RpS6在胚胎形成过程中的表达量显著高于幼虫、蛹和成虫(Martínez-Guitarteetal., 2007; Park and Kwak, 2012)；尖音库蚊RpS4在卵中高表达而在幼虫中低表达(Huetal., 2007)；褐飞虱NlRPL5在抱卵的雌成虫中最高，其次为若虫，雄成虫和刚羽化的雌成虫最低；RNAi沉默该基因导致卵巢发育迟缓、产卵量下降(Zhuetal., 2017)。上述研究表明，核糖体蛋白与昆虫生长发育，特别是与胚胎发育有关。通过对沙葱萤叶甲GdRpS3a在整个生命周期中的表达检测发现，几乎在整个昆虫的发育阶段都有表达。本研究中，GdRpS3a在沙葱萤叶甲不同发育阶段差异表达，卵及羽化40 d内成虫中的表达量显著低于幼虫、预蛹、蛹及羽化60 d后成虫中的表达量。前期研究表明，沙葱萤叶甲成虫秋季产卵后即以卵滞育越冬，越冬卵必须经过秋冬季的低温才能解除滞育(Zhouetal., 2016)。夏季成虫羽化后大量取食，约羽化7～10 d后停止取食或少量取食，活动停止，进入专性滞育状态。羽化约80～90 d后结束滞育，开始逐渐取食、交尾产卵等(陈龙等, 2018a)。核糖体蛋白在细胞分化活跃的组织中高表达(Jainetal., 2004; Martínez-Guitarteetal., 2007)。因此，GdRpS3a在细胞分化基本停滞的滞育卵和滞育前(3 d和7 d)及滞育前、中期(10、15、25和40 d)的成虫中表达量低而在生长发育较快的幼虫期、预蛹期、蛹期以及滞育后期(60 d)和解除后的成虫期(80 d和100 d)高表达是合理的。Reynaud等(1997)也发现RpS3a在未滞育的雌蚊中高表达，而在滞育的雌蚊中低表达。蛋白组学研究表明，包括RpS3a在内的多种核糖体蛋白在滞育解除后上调表达(Maetal., 2019)。因此，可认为RpS3a上调表达可能促进了沙葱萤叶甲成虫卵巢的发育，随着卵巢的发育，成虫夏滞育逐渐解除。但该推论还需通过对卵巢的解剖观察及其它实验进一步验证。

温度是影响昆虫生长发育及繁殖的重要因素之一。然而，目前温度对核糖体蛋白表达影响的研究却很少。本研究中，温度对沙葱萤叶甲GdRpS3a的表达有显著影响，但没有一定的规律性，表达量不随温度的上升而升高或下降。GdRpS3a在30℃下表达量最高，而超过30℃(35℃和40℃)表达量下降，这可能是因为高温不利于昆虫的生长发育。而Martínez-Guitarte等(2007)的研究却表明35℃高温对摇蚊RpL11和RpL13的表达无显著影响。造成差异的原因可能与核糖体蛋白或昆虫种类不同有关。