白及颗粒质量标准研究*

杨深应，陶明宝，董全玉，沈红春，杨胜芳，李 杉，赵兴蕊△

（1.云南省保山市食品药品检验检测中心，云南 保山 678000；2.云南省保山市隆阳区疾病预防控制中心，云南 保山 678000；3.保山中医药高等专科学校，云南 保山 678000）

白及颗粒由白及单味药材经加工制成，具有收敛、止血、补肺功效，临床用于治疗肺结核、慢性气管炎、百日咳、肺气肿，久咳伤肺、咯血吐血［1］。白及药材为兰科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥块茎［2］。因其种子繁育困难，野生资源急剧减少，不能满足市场需求，价格居高不下，导致市场上白及药材掺伪现象突出［3］。目前白及伪品主要有独蒜兰、云南独蒜兰、黄花白及、水白及、滇黄精、毛梗兰、杜鹃兰、紫花美冠兰、小白及、山慈菇、筒瓣兰等［4］，白及颗粒质量标准收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第十二册）》，仅有理化鉴别，无定性、定量检测项目［1］。参考文献［2－20］，本研究中建立了定性鉴别白及颗粒中白及药材的薄层色谱（TLC）法，以及测定白及药材中指标性成分1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯含量的高效液相色谱（HPLC）法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），包括G13l1C型四元泵带真空脱气机、G1329B型自动进样器、G1316A型柱温箱、G1315D型二极管阵列检测器、Agilent Chemstation型仪器控制及数据处理系统；SartoriusBP211D型电子天平（德国赛多利斯公司，精度为0.01 mg/0.1mg）；BPG－9140A型精密鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；A2S－10－BE型超纯水机（美国艾科浦国际有限公司）；SK2510LHC型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为35/53 kHz）。

1.2 试药

白及对照药材（中国食品药品检定研究院，批号为110770－201918）；1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯对照品（成都德思特生物技术有限公司，批号为DST190724－025，纯度为98.61%）；白及颗粒（企业A，云南玉药生物制药有限公司，批号分别为20200103，20200403，20200412，20180702；企业B，云南裕丰药业有限公司，批号分别为2006003，1912005 092，2004006，2004008；企业C，云南万裕药业有限公司，批号分别为1904002 097，1906004 081），规格均为每袋10 g；乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇、乙醇、磷酸、三氯甲烷等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

分别取10批样品，各5 g，研细，置锥形瓶中，加甲醇20 mL，超声（功率为250 W，频率为35 kHz）处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即得供试品溶液。取蔗糖适量，同法制备缺白及的阴性对照药材溶液。取白及对照药材1 g，同法制备白及对照药材溶液。按2020年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC法［8］试验，吸取上述供试品溶液、阴性对照药材溶液各20μL，白及对照药材溶液10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水（12∶1∶0.1，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷2%香草醛硫酸溶液显色，于105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的主斑点，且阴性对照无干扰。详见图1。

1－10.供试品溶液（批号分别为20200103，20200403，20200412，20180702，2006003，1912005 092，2004006，2004008，1904002 097，1906004 081）11.白及对照药材溶液 12.阴性对照药材溶液图1 薄层色谱图1－10.Test solution（batch numbers：20200103，20200403，20200412，20180702，2006003，1912005 092，2004006，2004008，1904002 097，1906004 081）11.Reference material solution of Bletillae Rhizoma 12.Negative reference medicinal material solutionFig.1 TLC chromatogram

2.2 1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈－0.1%磷酸溶液（22∶78，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：223 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。理论板数按1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯峰计应大于3 000。

1.1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯A.对照品溶液 B.供试品溶液C.阴性对照品溶液图2 高效液相色谱图1.militarineA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

2.2.2 溶液制备

取1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯对照品28.18 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解，定容，摇匀，得质量浓度为555.77μg/mL的对照品贮备液。取贮备液3 mL，置20 mL容量瓶中，加稀乙醇稀释成每1 mL含83.37μg的对照品溶液。取样品适量，研细，取1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为250 W，频率为35 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。按处方比例及工艺制备缺白及的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备缺白及的阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取2.2.2项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10μL，按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯色谱峰分离良好，且阴性对照无干扰。详见图2。

线性关系考察：分别精密吸取2.2.2项下对照品溶液（质量浓度为83.37μg/mL）1，5，10，15，20，25，30μL，按2.2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y＝1 585.367 31X－1.183 73，r＝0.999 9（n＝7）。结果表明，1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯进样量在0.083 4～2.501 1μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.2.2项下对照品溶液（质量浓度为83.37μg/mL）10μL，按2.2.1项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯峰面积的RSD为0.06%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为20200103）1.0 g，精密称定，共6份，依法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯含量的平均值为2.158 8 mg/g，RSD为0.43%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为20200103），依法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，4，8，12，18，24 h时进样测定峰面积。结果1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯峰面积的RSD为1.02%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量为2.158 8 mg/g的样品（批号为20200103）0.5 g，精密称定，共6份，依法制备供试品溶液，分别精密加入质量浓度为222.31μg/mL的对照品溶液5 mL，按2.2.1项下色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

2.2.4 样品含量测定

分别取10批样品，依法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定3次，记录峰面积，并计算样品中1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of militarine in the samples（n＝3）

3 讨论

3.1 TLC鉴别方法选择

考察了供试品溶液、对照药材溶液的制备方法，白及颗粒按2020年版《中国药典（一部）》白及药材项下TLC法制备供试品溶液及对照药材溶液［2］，结果供试品溶液色谱斑点比对照药材溶液色谱斑点少。考察了甲醇超声处理后蒸干溶解直接点样的方法，结果供试品溶液的色谱斑点与对照药材溶液的色谱斑点基本一致［6］。考察了环己烷－乙酸乙酯－甲醇（6∶2.5∶1，V/V/V）溶液，石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1，V/V/V）上层溶液，三氯甲烷－甲醇－水（12∶1∶0.1，V/V/V）溶液等不同展开系统的展开效果，以及10%硫酸乙醇溶液、1%香草醛－10%硫酸乙醇溶液、2%香草醛硫酸溶液的显色效果，结果以三氯甲烷－甲醇－水（12∶1∶0.1，V/V/V）溶液为展开剂时斑点的分离度较好，以2%香草醛硫酸溶液为显色剂时的显色较清晰。

3.2 检测波长选择

取1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯对照品溶液，采用紫外分光光度计于190～400 nm波长范围内扫描，结果1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯在223 nm波长处有最大吸收，故选择223 nm作为检测波长。

3.3 提取条件选择

考察了不同溶剂（乙醇、甲醇、70%甲醇、稀乙醇）的提取效果，结果提取溶剂为稀乙醇时待测成分的提取率最高。考察了不同超声时间（20，30，45，60 min）的提取效果，结果超声30 min已提取完全。故提取条件为稀乙醇超声提取30 min。

3.4 样品分析

现代药理学研究表明，1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯具有益智、延缓衰老、防治老年痴呆的功效，是白及药材的指标性成分，且含量较高［11－17］，故选择其作为白及颗粒含量测定的控制指标。本研究中建立了定性鉴别白及颗粒中白及药材的TLC法和1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯［8］的含量测定方法，并对10批同一厂家不同批号和不同厂家的白及颗粒进行了比较。结果TLC鉴别中10批样品的色谱斑点与白及对照药材色谱斑点基本一致，但同一厂家不同批号及不同厂家的白及颗粒中，1，4－二［4－（葡萄糖氧）苄基］－2－异丁基苹果酸酯含量差异较大，表明目前市场上流通的白及颗粒质量参差不齐，需进一步完善白及颗粒的质量控制标准。本研究中建立的方法操作简便，结果准确，稳定性和重复性均较好，可用于白及颗粒的质量控制。