基于AHP－CRITIC混合加权法的正交试验优选神气汤提取工艺*

王 强，张 湛，杨 彬，孟庆红，陈海兰，杨 博，张 勇

（1.北京中医医院顺义医院，北京 101300；2.天津中医药大学中医药研究院，天津 300000）

神气汤为国家级名老中医高才达主任医师总结的临床经验方，具有调补心肾、益气养阴功效，适用于免疫、内分泌、心血管功能等多系统失调人群，临床用于治疗慢性疲劳综合征（CFS）效果显著［1］。神气汤方中多糖具有增强造血功能、调节免疫、抗心肌缺血、保护外分泌腺等作用，君臣药单体成分党参炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、马钱苷、五味子醇甲等分别具有抗氧化、神经保护、抗炎、舒张血管等活性［2－6］，与本品功效相符。干膏率是固体制剂成型的重要保证［7］，故本研究中拟以上述活性成分的提取率及干膏得率为评价指标，采用L9（34）正交试验结合AHP－CRITIC混合加权法（简称AHP－CRITIC法）分配指标权重，并根据试验结果优化提取工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AE240型电子分析天平（瑞士Mettler公司，精度为十万分之一）；ALPHA2－4LDPLUS型冻干机（美国Christ公司）；UV－2700型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 试药

乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；甲酸（分析纯，美国Sigma试剂公司）；超纯水（自制）；党参炔苷对照品（批号为DST200325－035，含量为99.09%），毛蕊花糖苷对照品（批号为DST200709－061，含量为99.37%），松 脂 醇 二 葡 萄 苷 对 照 品（批 号 为DST200408－013，含量为98.85%），马钱苷对照品（批号为DST200628－038，含量为99.31%），五味子醇甲对照品（批号为DST191010－010，含量为99.86%），D（＋）－无水葡萄糖对照品（批号为DST200529－005，含量为99.03%），均购自成都德思特生物技术有限公司；党参（批号为18121117），盐杜仲（批号为19102101），麦冬（批号为18102201），五味子（批号为1909034），熟地黄（批号为1910044），山药（批号为19073002），枸杞（批号为18121813），山萸肉（批号为18122115），川牛膝（批号为1908008），菟丝子（批号为1903049），均购自北京盛世龙药业有限公司，经北京中医医院顺义医院张湛主任中药师鉴定为正品；神气汤（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 提取方法

综合考虑药材成分溶解性和预试验结果，结合文献［8－9］，最终确定以加水倍量（因素A）、提取次数（因素B）、提取时间（因素C）为考察因素，设计L9（34）正交试验。因素水平见表1，正交试验设计与结果见表2。

表1 L9（34）正交试验因素水平表Tab.1 The factor levels of the L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交试验设计与结果Tab.2 The design and results of the L9（34）orthogonal test

2.2 多糖含量测定

2.2.1 溶液制备

取D（＋）－无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释，即得质量浓度为100.02μg/mL的葡萄糖对照品溶液。分别精密吸取2.1项下正交试验中各组药液各50 mL，冻干，加80%乙醇100 mL，搅拌，静置12 h，弃去上清液，加入蒸馏水溶解，转移至500 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.2 方法学考察

线性关系考察：吸取葡萄糖对照品溶液适量，加水稀释，配成质量浓度分别为10.00，20.00，30.00，50.01，60.01，80.01μg/mL的系列对照品溶液，精密吸取上述溶液各2 mL，置10 mL具塞刻度试管中，各加入5 mL 0.2%蒽酮－硫酸试液，摇匀，迅速置冰水中冷却，置沸水浴中加热10 min，取出，冰水浴中冷却10 min，紫外可见分光光度计下于620 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度（C，μg/mL）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标进行线性回归，得回归方程A＝9.815 5C＋0.199 8，R2＝0.999 1（n＝6）。结果表明，葡萄糖质量浓度在10.00～80.01μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液2mL，于620 nm波长处测定吸光度，12 h内连续测定6次。结果的RSD为0.47%（n＝6），表明仪器日内精密度良好。精密吸取同一对照品溶液2 mL，于620 nm波长处每隔8 h测定吸光度，连续测定72 h。结果的RSD为1.89%（n＝9），表明仪器日间精密度良好。

稳定性试验：精密吸取2.2.1项下供试品溶液2 mL，于620 nm波长处分别于0，2，4，8，16，24 h时测定吸光度。结果的RSD为0.21%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：精密吸取提取药液2 mL，依法制备供试品溶液，于620 nm波长处测定吸光度。结果的RSD为0.56%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取2.2.1项下供试品溶液1mL，共6份，分别加入葡萄糖对照品溶液1 mL，于620 nm波长处测定吸光度，并计算多糖含量。结果多糖的平均回收率为99.01%，RSD为1.29%（n＝6），表明方法准确度高。

2.2.3 样品含量测定

精密吸取2.2.1项下供试品溶液，于620 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，并计算所测样品中多糖的含量。结果见表2。

2.3 党参炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、马钱苷、五味子醇甲含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）－0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min时20%A→40%A，11～20 min时40%A→80%A，21～25 min时80%A；26～40 min时80%A→40%A，41～50min时41%A→80%A）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测器：二极管阵列检测器（DAD）；检测波长：230 nm（松脂醇二葡萄苷、马钱苷），270 nm（党参炔苷、五味子醇甲），330 nm（毛蕊花糖苷）；进样量：10μL。

2.3.2 溶液制备

取党参炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、马钱苷、五味子醇甲对照品各适量，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，稀释，即得质量浓度分别为2.14，1.96，2.04，15.96，13.67μg/mL的混合对照品溶液。精密吸取2.1项下药液50 mL，加无水乙醇至含醇量达80%，搅拌，弃沉渣，取上清液减压蒸干，加10 mL甲醇溶解后转移至50 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。分别称取缺党参、熟地黄、盐杜仲、山茱萸、五味子的处方量药材，按2.1项下提取方法制备阴性水提液，按供试品溶液制备方法制备阴性对照药材溶液。

2.3.3 方法学考察

专属性试验：取2.3.2项下3种溶液各适量，按2.3.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液对应保留时间处有相应色谱峰出现，阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

1.松脂醇二葡萄苷 2.马钱苷 3.毛蕊花糖苷 4.党参炔苷5.五味子醇甲A.混合对照品溶液 B.供试品溶液 C.缺盐杜仲的阴性对照药材溶液 D.缺山萸肉的阴性对照药材溶液E.缺熟地黄的阴性对照药材溶液F.缺党参的阴性对照药材溶液G.缺五味子的阴性对照药材溶液图1 高效液相色谱图1.lobetyolin 2.acteoside 3.pinoresinol diglucoside 4.loganin 5.schisandrol AA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference medicinal material solution without stir－baked Eucommiae Cortexwith with salt solution D.Negative reference medicinal material solution without Corni Fructus E.Negative reference medicinal material solution without Rehmanniae Radix Praeparata F.Negative reference medicinal material solution without Codonopsis Radix G.Negative reference medicinal material solution without Schisandrae Chinensis FructusFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：取2.3.2项下混合对照品溶液适量，经0.45μm微孔滤膜滤过，分别精密吸取1，2，6，8，10，12μL，按2.3.1项下色谱条件进样测定。以质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表3。

表3 神气汤中5种成分含量测定方法学考察结果Tab.3 Results of the methodlogical investigations of content determination of five components in Shenqi Decoction

检测限和定量限确定：取党参炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、马钱苷、五味子醇甲对照品各适量，精密称定，分别用甲醇稀释。以信噪比（S/N）为3时的质量浓度为检测限，以S/N为10时的质量浓度为定量限。结果见表3。

精密度试验：精密吸取2.3.2项下混合对照品溶液10μL，按2.3.1项下色谱条件在12 h内连续进样测定6次，记录峰面积。结果各待测成分峰面积的RSD介于1.26%～2.08%（n＝6），表明仪器日内精密度良好。精密吸取2.3.2项下混合对照品溶液10μL，按2.3.1项下色谱条件每隔8 h进样测定1次，连续测定3 d。结果各待测成分峰面积的RSD介于1.63%～2.71%（n＝9），表明仪器日间精密度良好。

重复性试验：取2.1项下药液，分别按2.3.2项下方法制备供试品溶液，平行6份，分别按2.3.1项下色谱条件进样测定。结果各待测成分峰面积的RSD介于0.32%～2.57%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取2.3.2项下供试品溶液，共6份，分别按2.3.1项下色谱条件于0，2，4，8，16，24 h时进样测定。结果各待测成分峰面积的RSD介于0.12%～2.23%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：取已知含量的药液，依法制备供试品溶液，平行6份，精密加入2.3.2项下对照品溶液，按2.3.1项下色谱条件进样测定，并计算加样回收率。结果见表3。

2.4 干膏得率测定

分别精密吸取2.1项下药液50 mL，置已干燥至恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干，烘箱减压，干燥至恒定质量，取出，置干燥器中冷却30 min，称定质量，并计算干膏得率。结果见表2。

2.5 指标权重确立

AHP层次分析法（简称AHP法）确定权重系数：依据神气汤君臣佐使配伍规律及药理活性，将指标成分分成4个层次，优先顺序为多糖＞党参炔苷＝毛蕊花糖苷＞松脂醇二葡萄苷＝马钱苷＝五味子醇甲＞干膏得率。各项指标成分比较的判断优先矩阵结果见表4。采用SPSS 20.0统计学软件对相对评分进行层次分析，结果多糖、党参炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、马钱苷、五味子醇甲、干膏得率的权重系数分别为0.298 0，0.177 8，0.177 8，0.096 8，0.096 8，0.096 8，0.056 1，一致性比率（CR）＝0.005＜0.10，表明指标成分比较的判断优先矩阵具有满意的一致性，求得的权重系数有效。

表4 指标成对判断优先矩阵结果Tab.4 Pairwise comparison judgment prioritization matrix of indicators

CRITIC法确定权重系数：将表2中的数据经线性插值进行标准化处理［指标成分＝（实测值－最小值）/（最大值－最小值）］，采用SPSS 20.0统计学软件处理数据得相关系数矩阵，结果两两成分比较呈正相关，由公式［10－11］计算得到多糖、党参炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、马钱苷、五味子醇甲、干膏得率的权重系数分别为0.253 1，0.119 9，0.020 4，0.115 7，0.160 5，0.125 5，0.204 9。

AHP－CRITIC法确定权重系数：通过公式ωAHP－CRITICij＝ωAHPij×ωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij计算相关系数得多糖、党参炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、马钱苷、五味子醇甲、干膏得率的权重系数分别为0.500 3，0.141 4，0.021 4，0.074 3，0.103 0，0.080 6，0.076 3。

权重评分比较：采用上述3种评分系数分别对正交试验结果进行评分，结果见表5。通过相关系数分析，AHP法 与AHP－CRITIC法、CRITIC与AHPCRITIC法、AHP法与CRITIC法的相关系数分别为0.998 7，0.996 7，0.994 2，表明各数据间线性相关性强。考虑AHP－CRITIC法包含信息更科学、合理，故选择AHP－CRITIC法进行权重分配，即综合评分＝［（多糖/多糖最大量）×0.500 3＋（党参炔苷/党参炔苷最大量）×0.141 4＋（毛蕊花糖苷/毛蕊花糖苷最大量）×0.021 4＋（松脂醇二葡萄苷/松脂醇二葡萄苷最大量）×0.074 3＋（马钱苷/马钱苷最大量）×0.103 0＋（五味子醇甲/五味子醇甲最大量）×0.080 6＋（干膏得率/干膏得率最大量）×0.076 3］×100。

表5 3种赋权法对L9（34）正交试验评分结果（分）Tab.5 Scoring results of L9（34）orthogonal test by the three weighting methods（point）

2.6 AHP－CRITIC法对正交试验进行评分

根据AHP－CRITIC法权重系数对L9（34）正交试验结果进行综合评分，采用SPSS 20.0统计学软件处理数据。正交试验综合评分结果见表6，方差分析结果见表7。

表7 方差分析结果Tab.7 Results of the ANOVA

由表6可知，3个因素对综合评分的影响顺序为B＞A＞C，最佳提取工艺为A3B3C1。方差分析结果显示，因素B对综合评分结果有显著影响（P＜0.05），而因素A和因素C对综合评分结果无显著影响（P＞0.05）。考虑到后期工业生产成本，故最终确定提取工艺为A1B3C1，即加6倍量水，提取3次，每次30 min。

表6 AHP－CRITIC法对L9（34）正交试验综合评分结果Tab.6 Results of comprehensive score of the L9（34）orthogonal test based on AHP－CRITIC method

2.7 提取工艺验证

称取5倍处方量药材，加6倍量水，提取3次，每次30 min，测定各指标成分提取量、多糖含量和干膏得率。结果各指标均处于较高水平，表明工艺可行、合理。详见表8。

表8 提取工艺验证试验结果Tab.8 Results of the validation test of the extraction process

3 讨论

神气汤由12味药材组方，方中，党参、丹参补益心阴、养血通脉，共为君药；熟地黄、山药、枸杞、山萸肉、麦冬、川牛膝、盐杜仲、五味子、菟丝子补肾填精、滋肾水以制心火，共为臣药；砂仁开胃醒脾、使补而不滞、滋而不腻，共为使药。诸药合用，共奏滋补心肾、益气养阴之功效［1］。本研究中考虑中药复方在临床以多成分、多靶点发挥疗效，以及后续研制固体制剂要求，以多糖及君臣药单体含量、干膏得率为考察指标，系统、全面、有效地反映了提取物的信息。在多指标评价的中药提取工艺中，针对权重系数分配，目前常用方法有AHP法、CRITIC法。其中，AHP法虽体现了中药复方君臣佐使配伍的规律特点，但受研究者主观判断影响；CRITIC法权重结果受客观试验数据影响，忽略了中药复方各药材的配伍特点。而本研究中采用AHP－CRITIC法结合了不同类型赋权法的优点，主观与客观相结合，保证权重分配结果更稳定、可靠。

本研究中采用3D紫外光谱对君臣药各单体检测波长进行了考察，结果松脂醇二葡萄苷、马钱苷分别于277，205 nm波长处响应值最佳，但由于松脂醇二葡萄苷和马钱苷保留时间接近，两者于230 nm波长处吸收衰减较小，为了保持基线平稳，这2个成分检测波长选择230 nm；五味子醇甲、党参炔苷于270 nm波长处均有较大吸收，且末端吸收下基线较稳定；毛蕊花糖苷于330 nm波长处响应值最佳。参考文献［12］，最终选择在上述3个波长间切换进行测定。