响应面法优化夏枯草中总黄酮提取工艺及其抗氧化活性分析

李 鑫，赫 捷，赵 琳，薛 阳，周文君，刘 佳

（1.辽宁省朝阳市检验检测认证中心，辽宁 朝阳 122000；2.辽宁省朝阳市第二医院，辽宁 朝阳 122000；3.辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600）

夏枯草Prunella vulgarisL.为唇形科植物，性寒，味辛、苦，具有清泄肝火、散结消肿、清热解毒、祛痰止咳、凉血止血功效，用于治疗淋巴结核、甲状腺肿、乳痈、急性传染性黄疸型肝炎、细菌性痢疾等症［1］。现代药理学研究表明，夏枯草有较好的降血压作用［2］，主要成分为黄酮类物质［3］。黄酮类化合物对心血管系统有明显的药理作用，具有抗氧化、降血压、扩张血管、降低血管通透性、减少脆性、降低肝脂肪等作用［4］。基于中药质量标志物（Q－Marker）的概念［5］，所测成分的药效应与该药的药理作用一致。本研究中拟对夏枯草中总黄酮提取工艺及抗氧化活性进行研究［6－9］。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV2550型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；CPA225D型电子天平（精度为十万分之一），BSA224S－CW型电子天平（精度为万分之一），均购于赛多利斯科学仪器有限公司；9860A型超声波清洗器（天津市科贝尔光电技术有限公司，功率为500 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

夏枯草药材购于安徽亳州饮片市场，经辽宁省朝阳市检验检测认证中心张秀丽主任中药师鉴定为唇形科植物夏枯草的干燥果穗。芦丁标准品（中国食品药品检定研究院，批号为100080－20181，纯度为92.2%），1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH，批号为20180615），2，2′－联氮－双（3－乙基－苯并噻唑啉－6－磺酸）二铵盐（ABTS，批号为20180304），均购自北京索莱宝科技有限公司；乙醇（色谱纯，批号为20190117），维生素C（批 号 为20191202），硝 酸 铝（分 析 纯，批 号 为20161221），过硫酸钾（分析纯，批号为20160917），均购于国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠（批号为20170427），氢氧化钠（批号为20170329），均为分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 夏枯草总黄酮含量测定（紫外分光光度法）

对照品溶液制备：取芦丁标准品适量，精密称定，置100 mL容量瓶中，加50%乙醇溶液60 mL，超声溶解，加50%乙醇稀释至刻度，混匀，即得质量浓度为0.23 mg/mL的对照品溶液。

标准曲线确定：取芦丁对照品溶液0，1，2，4，6，8，10，15 mL，分别置25 mL容量瓶中，加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀，静置10 min；再加入1 mL 10%硝酸铝溶液，混匀，静置10 min；加入5 mL 4%氢氧化钠溶液，混匀，静置10 min，用50%乙醇溶液稀释至刻度。以空白试剂作为空白对照，于510 nm波长处测定吸光度值，记录各芦丁含量和吸光度，计算回归方程，得Y＝0.2066X＋0.004 8（r＝0.999 6，n＝8）。结果表明，芦丁含量在0.23～3.45 mg范围内与吸光度线性关系良好。

总黄酮提取量测定：分别取供试品溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液4 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，静置10 min；加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，静置10 min；加4%氢氧化钠溶液5 mL，静置10 min，加水定容至刻度，于510 nm波长处测定吸光度值。

2.2 提取影响因素单因素考察

乙醇体积分数：称取夏枯草药材20 g，共4份，分别加入300 mL体积分数分别为30%，50%，70%，90%的乙醇溶液，水浴加热提取，提取2次，每次1.5 h，滤出残渣，分别取滤液1 mL，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，得供试品溶液。依法测定总黄酮含量，由图1 A可知，乙醇体积分数为50%时夏枯草中总黄酮提取量最大。

料液比：称取夏枯草药材20 g，共4份，按液料比为20∶1（V/m），30∶1（V/m），40∶1（V/m），50∶1（V/m）分别加入50%乙醇溶液，水浴加热提取，提取1次，提取2 h，滤出残渣，分别取1 mL，置10 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，得供试品溶液。依法测定总黄酮含量，由图1 B可知，乙醇体积分数为50%，提取时间为2 h，液料比为40∶1（V/m）时，夏枯草中总黄酮提取量最高，继续增大液料比，提取效果无明显改善。

提取时间：称取夏枯草药材20 g，共5份，分别加入800 mL 50%乙醇溶液，水浴加热提取，提取1次，分别提取2，3，4，5，6 h，滤出残渣，取1 mL置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容，得供试品溶液。依法测定总黄酮含量，由图1 C可知，乙醇体积分数为50%，液料比为40∶1（V/m），提取时间为5 h时夏枯草总黄酮的提取量最高，继续延长提取时间，提取效果不明显。

单因素考察结果：确定了各影响因素的最佳水平，乙醇体积分数为50%，提取时间为5 h，液料比为40∶1（V/m），初步确定了夏枯草中总黄酮的提取工艺。

2.3 提取工艺（响应面法）

试验设计：在单因素试验结果的基础上，根据Box－Behnken中心组合试验设计原理，选取乙醇体积分数（因素A）、液料比（因素B）和提取时间（因素C）3个因素，采用三因素三水平的响应面分析方法，因素水平见表1。以液料比、乙醇体积分数和提取时间为自变量，总黄酮提取量为响应值，在提取1次的条件下，共安排17个试验，其中12个为析因试验，5个为中心试验，用以估计误差。试验方案及结果见表2。

表1 试验设计因素水平Tab.1 Factors and levels of single－factor test

表2 试验设计方案与结果Tab.2 Scheme and results of test design

A.乙醇体积分数 B.液料比 C.提取时间图1 夏枯草中总黄酮提取影响因素单因素考察A.Volume fraction of ethanol B.Liquid－solid ratio C.Extraction timeFig.1 Single－factor test of the factors affecting the extraction of total flavonoids from Prunellae Spica

模型拟合与方差分析：采用Design Expert软件中的Box－Behnken试验对响应值（总黄酮提取量）进行二次回 归 分 析，结 果R＝－7.470＋0.473A＋0.155B＋2.462C＋0.000 500AB＋0.006 43AC－0.001 77BC－0.005 71A2－0.001 97B2－0.257C2（R2＝0.998 4）。由表3可知，模型项的Pr＞F值小于0.000 1，表明该二次方程回归极显著，且失拟项Pr＞F值为0.072 9，不显著，说明该方程对试验拟合较好，可较好地描述各因素与响应值间的真实关系。一次项A，B，C，二次项A2，B2，C2对响应值的影响显著（P＜0.01），交互项对响应值的影响均不显著（P＞0.05）。因此，各因素对响应值的影响不是简单的线性关系。根据回归方程系数的估计值可知，各因素对夏枯草中总黄酮提取量的影响大小为乙醇体积分数＞提取时间＞液料比。在α＝0.05显著水平下剔除不显著项后，可得优化后的回归方程R＝－7.470＋0.473A＋0.155B＋2.462C－0.005 71A2－0.001 97B2－0.257C2。

表3 模型拟合方差分析结果Tab.3 Results of ANOVA for model fitting

响应面分析：不同因素交互作用的响应面见图2。由图2 A可知，当提取时间为5 h时，总黄酮提取量随乙醇体积分数的升高先升后降，提示料液比对提取量的影响较小。由图2 B可知，当液料比为40∶1时，总黄酮提取量随乙醇体积分数的升高先升后降，提示提取时间对其影响较小。由图2 C可知，总黄酮提取量随液料比和提取时间的变化影响不大。

A.乙醇体积分数－提取时间 B.乙醇体积分数－液料比 C.液料比－提取时间图2 各因素交互作用影响总提取量的响应面和等高线图A.Volume fraction of ethanol－extraction time B.Volume fraction of ethanol－liquid－solid ratio C.Liquid－solid ratio－extraction timeFig.2 Response surface and contour map of the interaction of various factors on the total extraction amount of total flavonoids from Prunellae Spica

2.4 提取条件优化及验证

根据回归模型可预测理论，响应值最大时的提取条件 为：A＝55.95，B＝44.34，C＝5.36，即 提 取 量 为181.307 mg，液料比44.34∶1（V/m），提取时间5.36 h。考虑到实际操作条件，拟定夏枯草总黄酮最佳提取条件为液料比44∶1（V/m），提取时间5 h，乙醇体积分数55%。以此提取条件检验响应面分析法建立回归模型的正确性，测得总黄酮的提取量为173.341 mg，与理论预测值相比，差异不显著。提示该回归模型与实际情况拟合很好，响应面法可用于对夏枯草总黄酮提取条件进行回归分析和参数优化。

2.5 抗氧化活性分析

DPPH自由基清除率测定：取总黄酮提取液和维生素C，分别配制质量浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL的供试品溶液和阳性对照溶液，分别取1.0 mL，加入1.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，混匀，室温下充分反应30min，于517nm波长处测定吸光度，计算清除率。DPPH自由基清除率（%）＝（1－Ai/A0）×100%。式中，A0表示DPPH溶液的吸收值；Ai表示样品与DPPH混合液的吸收值［10－11］。

ABTS＋·自由基清除率测定：取总黄酮提取液和维生素C，分别配制成质量浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL的供试品溶液和阳性对照溶液，分别取0.8 mL，精密量取稀释后的ABTS＋·贮备液1.2 mL，混匀，静置5 min，于734 nm波长处测定吸光度，按公式计算自由基清除率。

抗氧化活性分析：结果见图3。总黄酮质量浓度在0.02～0.12 mg/mL范围内，阳性对照溶液及夏枯草总黄酮提取物质量浓度随着DDPH和ABTS＋·自由基清除率的增加而增加。在清除DPPH自由基试验中，其半数清除质量浓度（IC50）和最大清除率分别为0.042 mg/mL和70%，维生素C分别为0.085 mg/mL和84%；在清除ABTS＋·自由基试验中，其IC50和最大清除率分别为0.074 mg/mL和82%，维生素C分别为0.048 mg/mL和90%。结果显示，夏枯草总黄酮提取物对DPPH和ABTS＋·自由基均有良好的清除效果，但不如维生素C。

A.DPPH自由基 B.ABTS＋·自由基图3 夏枯草中总黄酮提取物对DPPH和ABTS＋·自由基的清除效果A.DPPH free radical B.ABTS＋·free radicalFig.3 Scavenging effect of total flavonoids from Prunellae Spica on DPPH and ABTS＋·free radicals

3 讨论

3.1 统计方法选择

现有文献中关于夏枯草提取总黄酮的条件优化研究多采用的数理统计方法为正交设计法，其可同时考虑多种因素，并通过较少的试验次数得到最佳因素水平组合，但不能在给定的连续区域内找到因素和响应值的对应关系（回归方程）。但响应面分析法试验次数少，周期短，求回归方程精度高，可满足其不足。

3.2 回归方程

在单因素考察结果基础上，以夏枯草总黄酮提取量为响应值，利用试验设计软件Design－Expert，采用Box－Behnken试验原理建立了乙醇体积分数（%）、液料比和提取时间（h）与总黄酮提取量间的二次回归模型，回归模型拟合程度好，能真实反映各影响因素对响应值的影响。根据回归系数显著性检验结果，得到各因素对响应值影响的顺序为乙醇体积分数＞提取时间＞液料比。

3.3 单因素考察和响应面考察优缺点

首先采用单因素考察法确定影响因素变量的大概最优范围，作为响应面的零水平点，可减少响应面试验所做的试验数量，主要选取影响提取时间、液料比和乙醇体积分数影响较大的独立因素进行优化。单因素考察仅单独考察某个因素的影响，在实际试验中要综合考虑各因素间的干扰影响，故需要选择较全面的响应面考察法，优选样品提取的最佳工艺。

3.4 抗氧化活性

在筛选夏枯草中总黄酮最佳提取工艺的基础上，对夏枯草中总黄酮抗氧化活性进行了初步研究，发现夏枯草中总黄酮对DPPH自由基和ABTS＋·自由基均有良好的清除作用，可为夏枯草的生物活性研究提供理论依据。