乙醇法制备葛花醇提物的工艺优化及其抗氧化活性*

陈惠卿，陈惠婷，张颖，谢三都,3，张怡

（1.福建农林大学 食品科学学院，福建 福州 350002； 2.闽南科技学院 生命科学与化学学院，福建 泉州362332；3.闽南科技学院 食品科学研究所，福建 泉州 362332）

葛花（Puerariae Flos）属豆科植物野葛的花蕾，富含多种生物活性成分，包括黄酮类化合物、皂苷类、花青素、氨基酸、生物碱类及挥发油等，且黄酮类化合物含量最高，是葛花的主要功能性成分[1,2]。现代医学研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化，降血脂，降血糖，消除炎症等生理药理功效，是开发功能性食品和制备高效低毒药物的重要原料[3-5]。因此，葛花作为传统的药食兼用原料备受科研界关注。

黄酮类化合物属于自然界中分布较广的酚类物质，为植物生长过程中产生的一类次生长代谢产物，主要包括黄烷-3-醇、花色苷和黄酮，是一种天然抗氧化剂[6-9]。黄酮类化合物难溶于水，不具挥发性，易溶于有机溶剂和稀碱液，常见的提取方法有醇提法、碱法、有机溶剂萃取法、微波辅助提取、超声波辅助提取等[10-12]。其中，醇提法具有产物杂质少、提取率高、对设备要求简单等优点[13,14]。本文以葛花为原料，以葛花总黄酮为指标，采用乙醇浸提法制备葛花醇提物，在考察了乙醇浓度、料液比、浸提温度和时间对葛花醇提物中总黄酮提取效果影响的基础上，应用正交试验设计优化其提取工艺条件；同时，以茶多酚为阳性对照，通过探讨葛花醇提物对羟自由基、超氧自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除效果来研究其体外抗氧化性能。研究为进一步利用葛花资源提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验原料与试剂

原料：葛花，东南医药连锁有限公司。

试剂：芦丁标准品，生化试剂，上海源叶生物科技有限公司；硫酸亚铁、1,10-菲咯啉、双氧水、无水乙醇、三羟甲基氨基甲烷、浓硝酸，西陇科学股份有限公司；无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、焦性没食子酸、硫酸铁、三氯乙酸，国药集团化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷，山东西亚化学工业有限公司；2,2-联苯基-1-苦基肼基，上海麦克林生化科技有限公司；以上药品均为分析纯。2-硫代巴比妥酸试剂，生物试剂，西陇科学股份有限公司。茶多酚，食品级，江西富之源生物科技有限公司。

1.2 试验仪器与设备

BO-150T多功能粉碎机，永康铂欧五金厂；RV10数显旋转蒸发仪，广州仪科实验室技术有限公司；LGJ-12型真空冷冻干燥机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TDL-60C低速台式离心机，泉州天美化工仪器有限公司；78-1磁力搅拌机，金坛市富华仪器有限公司；HWS-28恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；FA2004电子天平，上海衡平仪器仪表厂；721型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；N4S紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；FC-6烘干箱，广东多丽食品机械有限公司；G-100s 超声波清洗机，深圳市歌能清洗设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 葛花醇提物的制备工艺流程

葛花粉碎、过80目筛，40 ℃下烘干至恒重→乙醇溶液恒温浸提→提取液过滤除渣→滤液真空浓缩→浓缩液冷冻干燥→冻干品冷藏贮存。

1.3.2 芦丁标准曲线的制作

以芦丁为标准品，参照钱慧琴[15]等文献中所述三氯化铝显色法绘制标准曲线，所得标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

如图1所示，芦丁标准曲线的回归方程为：y=1.2394x+0.0025，相关系数R2=0.9995，说明芦丁标准溶液在质量浓度为0~0.5 mg/mL范围内，有良好的线性关系。

1.3.3 葛花醇提物中总黄酮提取率的测定

参照标准曲线的测定方法，准确称取一定量的葛花醇提物冻干粉，溶于相应体积分数的乙醇溶液中，用25 mL的容量瓶定容，充分摇匀后常温静置30 min，同时以相应体积分数的乙醇溶液代替样品做空白试验。按以下公式计算葛花总黄酮提取率（%）：

式中：

1.3.4 葛花总黄酮提取工艺优化

1.3.4.1 料液比对葛花总黄酮提取率的影响

准确称取0.5 g葛花粉末，分别按料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100 g/mL的比例加入体积分数为30%的乙醇溶液，在60 ℃下恒温水浴提取10 min，抽滤除渣，滤液冷冻干燥；取一定量的葛花总黄酮冻干粉溶于体积分数为30%的乙醇溶液中，按标准曲线测定方法测定葛花总黄酮提取率，重复3次。

1.3.4.2 乙醇体积分数对葛花总黄酮提取率的影响

准确称取0.5 g葛花粉末，按料液比为1∶80(g/mL)的比例分别加入体积分数为5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%的乙醇溶液，在60 ℃下恒温水浴提取10 min，抽滤除渣，滤液冷冻干燥；取一定量葛花总黄酮冻干粉溶于相应体积分数的乙醇溶液中，按标准曲线测定方法测定葛花总黄酮提取率，重复3次。

1.3.4.3 浸提温度对葛花总黄酮提取率的影响

准确称取0.5 g葛花粉末，按料液比为1∶80(g/mL)的比例加入体积分数为10%的乙醇溶液，分别在30、40、50、60、70、80、90 ℃下恒温水浴提取10 min，抽滤除渣，滤液冷冻干燥；取一定量的葛花总黄酮冻干粉溶于体积分数为10%的乙醇溶液中，按标准曲线测定方法测定葛花总黄酮提取率，重复3次。

1.3.4.4 浸提时间对葛花总黄酮提取率的影响

准确称取0.5 g葛花粉末，按料液比为1∶80(g/mL)的比例加入体积分数为10%的乙醇溶液，在50 ℃下分别恒温水浴提取5、10、15、20、25、30、35 min，抽滤除渣，滤液冷冻干燥；取一定量的葛花总黄酮冻干粉溶于体积分数为10%的乙醇溶液中，按标准曲线测定方法测定葛花总黄酮提取率，重复3次。

1.3.4.5 乙醇浸提法提取葛花总黄酮的正交试验

在单因素试验的基础上，以总黄酮提取率为考察指标，探讨料液比（A）、乙醇体积分数（B）、浸提温度（C）和时间（E）对葛花总黄酮提取效果的影响，采用5因素4水平正交试验设计L16(45)优化葛花总黄酮的提取工艺条件，其因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3.5 葛花醇提物抗氧化性能的测定

1.3.5.1 茶多酚溶液的制备

参照文献[16]中茶多酚溶液的制备方法，具体如下：准确称取1.00 g的茶多酚，用蒸馏水溶解后定容至500 mL，制备成2.0 mg/mL的茶多酚溶液，并稀释成浓度所需要各浓度的茶多酚溶液，备用。

1.3.5.2 葛花醇提物对羟自由基清除能力的测定

以茶多酚作为阳性对照，配制不同浓度葛花醇提物，参照芦丁标准曲线的测定方法测定葛花醇提物中葛花总黄酮浓度，参考陈红梅[17]等文献中所述羟自由基清除率的测定方法研究葛花醇提物清除羟自由基的性能，重复3次。

1.3.5.3 葛花醇提物对超氧自由基清除能力的测定

以茶多酚作为阳性对照，配制不同浓度葛花醇提物，参照芦丁标准曲线的测定方法测定葛花醇提物中葛花总黄酮浓度，参考杨喆[18]等文献中所述超氧自由基清除率的测定方法研究葛花醇提物清除超氧自由基的性能，重复3次。

1.3.5.4 葛花醇提物对DPPH自由基清除能力的测定

以茶多酚作为阳性对照，配制不同浓度葛花醇提物，参照芦丁标准曲线的测定方法测定葛花醇提物中葛花总黄酮浓度，参考韦献雅[19]等文献中所述DPPH自由基清除率的测定方法研究葛花醇提物清除DPPH自由基的性能，重复3次。

1.3.5.5 葛花醇提物对ABTS自由基清除能力的测定

以茶多酚作为阳性对照，配制不同浓度葛花醇提物，参照芦丁标准曲线的测定方法测定葛花醇提物中葛花总黄酮浓度，参考CAMPOS[20]等文献中所述ABTS自由基清除率的测定方法研究葛花醇提物清除ABTS自由基的性能，重复3次。

1.3.6 数据处理

采用SPSS 23.0数据分析软件对变化显著性分析；使用EXCEL软件对数据进行统计分析并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 葛花总黄酮提取工艺优化

2.1.1 料液比对葛花总黄酮提取率的影响

如图2所示，葛花总黄酮提取率随料液比的增大整体呈现先缓慢上升后趋于平稳的现象。当料液比为1∶80(g/mL)时，葛花总黄酮提取率达到最高值为(1.93±0.042)%，P＜0.01。溶质和溶剂接触的表面积会随溶剂量的增大而增加，从而加速溶质的溶出，葛花总黄酮提取率上升；而随着溶剂量的继续增加，总黄酮基本都已溶出，提取率不再有显著变化[21]。因此，料液比宜选择1∶80(g/mL)。

图2 不同料液比对葛花总黄酮提取率的影响

2.1.2 乙醇体积分数对葛花总黄酮提取率的影响

如图3所示，随着乙醇浓度的增大，葛花总黄酮提取率呈现先显著升高再陡降，而后趋于平稳，进而急剧下降的现象。当乙醇浓度为10%时，葛花总黄酮提取率最高为(1.98±0.028)%，P＜0.01。一方面，乙醇体积分数不同其极性亦不同，葛花总黄酮的极性可能与体积分数为10%的乙醇溶液最为接近，根据相似相溶原理，黄酮类化合物在此时能最大限度从固体载体中转移到溶液中，故溶解度最高[22]；另一方面，植物组织中含有多种醇溶性物质，如色素、精油等，而高浓度的乙醇溶液会增加这些成分的溶出量，使之同黄酮类化合物竞争乙醇-水分子体系，从而表现为总黄酮提取率在保持平衡一段时间后出现下降的现象[23]。因此，乙醇溶液体积分数宜选择10%。

图3 不同乙醇体积分数对葛花总黄酮提取率的影响

2.1.3 浸提温度对葛花总黄酮提取率的影响

如图4所示，随着浸提温度的上升，葛花总黄酮提取率呈现先缓慢上升后急剧下降的趋势。当浸提温度为50 ℃时，葛花总黄酮提取率达到最高值为(2.21±0.057)%，P＜0.05，但30、40、50 ℃三个水平在α=0.01水平上差异不显著。黄酮类化合物的结构在高温作用下会被破坏，且高温也会使乙醇挥发，浓度下降，表现为总黄酮提取率下降[24]。因此，浸提温度选择50 ℃左右为宜。

图4 不同浸提温度对葛花总黄酮提取率的影响

2.1.4 浸提时间对葛花总黄酮提取率的影响

如图5所示，随着浸提时间的延长，葛花总黄酮提取率先显著升高后大幅度下降。当浸提时间为10 min时，葛花总黄酮提取率达到最大值为(2.40±0.028)%，P＜0.01。延长浸提时间，溶剂对溶质的溶胀和渗透作用有助于黄酮类物质向溶剂扩散，提取率上升；但过度延长浸提时间，葛花中其他醇溶性物质大量溶出，与黄酮类物质共同竞争溶出，从而导致总黄酮提取率骤降[25]。因此，浸提时间以10 min为宜。

图5 不同浸提时间对葛花总黄酮提取率的影响

2.1.5 乙醇浸提法提取葛花总黄酮的正交试验

如表2所示，根据正交试验结果分析，比较各列的极差结果R值可知，RE＞RB＞RA＞RC，即各因素对葛花总黄酮提取率的影响程度大小为浸提时间（E）＞乙醇体积分数（B）＞料液比（A）＞浸提温度（C）；即在试验所设定的因素水平中，浸提时间对葛花总黄酮提取率的影响最为显著，其次是乙醇体积分数和料液比，浸提温度的影响程度最小。通过对K值的比较可知，A3B4C1E3为最优组合，即乙醇体积分数30%，料液比1∶80 (g/mL)，浸提温度30 ℃，浸提时间15 min。为验证最优工艺的有效性，以最优组合提取葛花总黄酮，重复3次，所得葛花总黄酮提取率为(2.71±0.018)%，RSD=0.9327%，表明该提取工艺条件稳定可行。

表2 正交试验结果与分析

2.2 葛花醇提物抗氧化性能的研究

2.2.1 葛花醇提物清除羟自由基性能的研究

如图6所示，葛花醇提物对羟自由基的清除能力随其含有的葛花总黄酮质量浓度的增大而加强，且具有极显著影响，P＜0.01，这与陈红梅[17]、李玲[26]等对黄酮类物质抗氧化性能的研究结果相一致，表明葛花醇提物对羟自由基的清除效果与其含有的葛花总黄酮呈现显著的量效关系。当葛花醇提物中葛花总黄酮质量浓度为0.047 mg/mL时，其对羟自由基的清除率显著高于0.2 mg/mL的茶多酚，P＜0.01，表明葛花醇提物对羟自由基有较强的清除能力。

图6 葛花醇提物对羟自由基清除能力的影响

2.2.2 葛花醇提物清除超氧自由基性能的研究

如图7所示，葛花醇提物对超氧自由基的清除能力随其含有的葛花总黄酮质量浓度的增大而显著加强，且具有极显著影响，P＜0.01，这与罗秋水[27]、张兆英[28]、张晓文[29]等关于植物黄酮类物质对超氧自由基的清除能力研究相一致，表明葛花醇提物对超氧自由基的清除效果与其含有的葛花总黄酮呈现显著的量效关系。当葛花醇提物中葛花总黄酮质量浓度为0.019 mg/mL时，其对超氧自由基的清除率显著高于0.5 mg/mL的茶多酚，P＜0.01，表明葛花醇提物对超氧自由基有较强的清除能力。

图7 葛花醇提物对超氧自由基清除能力的影响

2.2.3 葛花醇提物清除DPPH自由基性能的研究

如图8所示，葛花醇提物对DPPH自由基的清除能力随其含有的葛花总黄酮质量浓度的增大而加强，且具有极显著影响，P＜0.01，表明葛花醇提物对DPPH自由基的清除效果与其含有的葛花总黄酮呈现显著的量效关系。因为黄酮类化合物分子和茶多酚中均含有具备供氢能力的酚性羟基，当孤对电子与还原态氢进行配对时，DPPH·即被还原形成DPPH-H，表现出显著的抗氧化能力[30]，当葛花醇提物中葛花总黄酮质量浓度为0.026 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率与0.05 mg/mL的茶多酚无差异，P＞0.05，表明了葛花醇提物对DPPH自由基有较强的清除能力。

图8 葛花醇提物对DPPH自由基清除能力的影响

2.2.4 葛花醇提物清除ABTS自由基性能的研究

如图9所示，葛花醇提物对ABTS自由基的清除能力随其含有的葛花总黄酮质量浓度的增大而加强，且具有极显著影响，P＜0.01，表明葛花醇提物对ABTS自由基的清除效果与其含有的葛花总黄酮呈现显著的量效关系。不同于供氢清除DPPH自由基，ABTS自由基被抗氧化剂清除的过程是电子转移过程，而黄酮类化合物和茶多酚均具备较强电子供应能力[31]，当葛花醇提物中葛花总黄酮质量浓度为0.038 mg/mL时，其对ABTS自由基的清除率与0.15 mg/mL的茶多酚无差异，P＞0.05，表明了葛花醇提物对ABTS自由基有较强的清除能力。

图9 葛花醇提物对ABTS自由基清除能力的影响

3 结论

在采用乙醇法提取葛花总黄酮过程中，在所选因素与水平范围内，料液比、乙醇体积分数、浸提温度、浸提时间对葛花总黄酮提取率的影响极显著，P＜0.01，其最佳提取工艺条件为乙醇体积分数30%、料液比1∶80 g/mL、浸提温度30 ℃、浸提时间15 min，在此工艺条件下葛花总黄酮提取率为(2.71±0.018)%。综合葛花醇提物对羟自由基、超氧自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力可知，葛花醇提物中葛花总黄酮浓度不同对其抗氧化能力的影响差异极显著，P＜0.01，且呈现明显的剂量效应。以茶多酚作阳性对照，葛花醇提物具有较强的抗氧化能力。