不同甜橙品种胚性愈伤组织的诱导

欧阳欢， 熊遂金， 陈健美， 钟八莲

(赣南师范大学 生命科学学院，江西 赣州 341000)

以柑橘黄龙病为代表的柑橘病害，对我国乃至全球柑橘产业的健康持续发展造成了严重的影响。目前，全球已发现80余种柑橘病毒类病害，而在我国已超过15种柑橘病毒及类病毒被报道[1-2]。胚性愈伤组织是利用柑橘珠心胚脱毒及原生质体融合等生物技术育种的重要材料。柑橘珠心胚主要由珠心胚原基细胞发育而成，它们起源于珠心组织珠孔端的一两层细胞内，在珠孔到珠心的中间、胚囊边缘第1层及邻近珠被的珠心外表皮甚至合点端有时也偶尔存在珠心胚原基细胞，珠心胚原基细胞的细胞核大，细胞质浓厚，明显区别于其他细胞，并形成厚细胞壁将其与周围珠心组织隔离开来[3]。病毒通常是经过维管束的韧皮部传播的，而珠心与维管系统无直接联系，由珠心细胞诱导发生的植株可以免除病毒的危害[4]。但珠心胚大多是不育的，必须分离培养才能发育成正常的幼苗。Navarro等[5]用组织培养的方法，从单胚性的克里曼丁橘上培养出了无病毒的良种珠心苗。高峰等[6]对华盛顿脐橙的未受精胚珠进行离体培养获得了脱去裂皮病和衰退病的无病毒珠心苗。对于具有多胚性的柑橘品种来说，珠心胚可取自种子中的非合子胚，但是对于单胚性或无籽的柑橘品种，珠心胚只能通过未受精胚珠进行离体组织培养来获得。本研究是在组织培养的基础上，以赣南早脐橙、纽荷尔脐橙、哈姆林甜橙不同发育时期果实的未受精胚珠为外植体，通过比较不同取样时间及诱导培养基下的未受精胚珠愈伤诱导率和胚性愈伤诱导率，以期建立一个高效的甜橙胚性愈伤组织诱导体系。

1 材料与方法

1.1 材料

赣南早脐橙、纽荷尔脐橙、哈姆林甜橙取自国家脐橙工程技术研究中心柑橘种质资源圃。从2019年6月9日起至8月27日，每隔10 d取1次赣南早脐橙、纽荷尔脐橙和哈姆林甜橙的果实，共取样9次。3个品种的花期在4月初左右，第1次采样的时间记为花后65 d，之后取样时间以此推算。

1.2 方法

将取回的柑橘果实用自来水清洗干净表皮后，在超净台用75%乙醇表面消毒，无菌水清洗，将果实剖开，去掉果肉，可发现囊衣内紧靠中柱处有许多未发育的小胚珠，长1～2.5 mm。用小镊子将这些小胚珠轻轻挑下，放入预先配置好的5种培养基中进行暗培养，每种培养基设置3个重复。培养材料30 d继代1次，60 d后记录数据。基础培养基是MT+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂，在此基础上添加不同激素，配置成5种不同培养基(表1)。

表1 诱导培养基激素配方

1.3 数据处理

出愈率=形成愈伤组织个数/外植体接种总数×100%。

胚性愈伤组织诱导率=形成胚性愈伤组织个数/外植体接种总数×100%。

数据整理及分析采用Microsoft Excel 2007软件，作图采用SigmaPlot 13软件。

2 结果与分析

试验获得的甜橙愈伤组织分为胚性细胞和非胚性细胞2种，二者在细胞形态和结构上有很大区别。柑橘的胚性和非胚性愈伤组织的外观形态差异如图1所示。柑橘的胚性愈伤组织是白色或乳白色的疏松的愈伤组织颗粒或愈伤团，能够较快地增殖并能长期继代保存；非胚性愈伤组织是米黄色的致密愈伤组织块，几乎不增殖，易于再生芽。非胚性愈伤组织不能继代保存，而胚性愈伤组织能够较快的增殖并能长期继代保存。

A—刚接种未受精胚珠；B—诱导60 d获得的非胚性愈伤组织；C—诱导60 d获得的胚性愈伤组织；D—胚性愈伤组织经分化培养30 d后的生长状态。

2.1 赣南早脐橙诱导培养基及采样时间的筛选

5种培养基对赣南早脐橙未成熟胚珠诱导成愈伤组织均有效，尤其是培养基E，其愈伤诱导率在88.74%～100%，诱导效果显著。但是，培养基E对赣南早脐橙胚性愈伤组织的诱导效果不佳，最高只有12.78%，即培养基E诱导的愈伤基本为非胚性愈伤组织。培养基A对赣南早脐橙未成熟胚珠的愈伤在115 d达到最好效果，为97.02%；其次在125 d为96.11%，最低出愈率是61.90%，但整个采样时间胚性愈伤率都非常低，除了在早期65 d和75 d时有少量胚性愈伤被诱导，出愈率分别为7.41%和2.09%，其余时间取样的胚性愈伤诱导率为0。培养基B诱导的胚性愈伤诱导率最高只有10.00%，即赣南早脐橙未成熟胚珠经培养基B诱导的愈伤大部分为非胚性愈伤，只有少部分为胚性愈伤组织。赣南早脐橙未受精胚珠经培养基C诱导后，其出愈率在75 d达到最大值，并在105 d开始下降，降至145 d的66.67%，同时培养基C诱导后的胚性愈伤率在整个采样时期呈现先升后降趋势，在95 d达到峰值为23.64%。而经培养基D诱导后，赣南早脐橙未受精胚珠愈伤诱导率在85 d达到最高值为97.77%，从95 d开始下降，而胚性愈伤率在105 d达到最高值为35.90%(图2)。综上，培养基A和E对赣南早脐橙未受精胚珠愈伤诱导较好，但是胚性愈伤效果不显著，要得到较多的赣南早脐橙胚性愈伤组织则应使用培养基D，在105 d进行采样。

图2 赣南早脐橙在5种不同培养基的愈伤诱导组织情况

2.2 纽荷尔脐橙诱导培养基及采样时间的筛选

纽荷尔脐橙未受精胚珠经培养基A诱导的出愈率在105 d达到最大值81.98%，最小值为125 d的36.35%，但是其胚性愈伤率最高仅有1.85%，说明培养基A对于胚性愈伤的诱导效果不显著。培养基B的出愈率在95 d之前保持在95.29%，从105 d开始下降，最低到达135 d的69.68%，同时经培养基B诱导后的胚性愈伤率也在95 d达到最高值，为19.81%，且从105 d后开始下降，最低降至135 d的0.95%。纽荷尔脐橙未受精胚珠经培养基C诱导后的出愈率在75 d和85 d达到最高值，均为100%，从105 d开始下降，在125 d达到最低值为70.00%；其胚性愈伤诱导率在95 d达到最大值56.21%，之后开始下降，即纽荷尔脐橙未受精胚珠经培养基C诱导后，采样时间为95 d的愈伤诱导率较高且胚性愈伤诱导率也最高。培养基D的愈伤诱导率在105 d以前保持在90.00%以上，105 d以后略有下降；而培养基D诱导的胚性愈伤率在95 d达到最高值32.51%，在75～95 d期间呈上升趋势，95～145 d期间呈下降趋势。培养基E对纽荷尔脐橙未受精胚珠的胚性愈伤诱导在整个采样时期效果均不佳，但出愈率保持在92.57%以上(图3)。综上，纽荷尔脐橙未受精胚珠经培养基A、E诱导后得到的愈伤基本为非胚性愈伤组织，且培养基E的诱导效果要优于培养基A，而培养基B、C、D诱导的胚性出愈率在95 d采样时间达到最大值，其中培养基C的诱导效果最显著，即纽荷尔脐橙未受精胚珠在95 d采样使用培养基C诱导效果最佳。

图3 纽荷尔脐橙在5种不同培养基的愈伤组织诱导情况

2.3 哈姆林甜橙诱导培养基及采样时间的筛选

哈姆林甜橙未受精胚珠经培养基A诱导后的出愈率在85 d达到最大值73.86%，而胚性愈伤率则仅在125 d达到最高值5.87%，即培养基A诱导对胚性愈伤的效果不显著。经培养基B诱导后的出愈率在采样前期保持在一个较高的水平，最低只有92.06%，在最后两次采样时开始呈下降趋势，但胚性愈伤率在65～95 d呈上升趋势，在95 d达到最高27.78%。培养基C的愈伤诱导效果显著，胚性愈伤率在65～95 d呈上升趋势，且在95 d达到最高值65.08%，95 d至采样结束呈下降趋势，在135 d达到最低值2.86%。对培养基D来说，哈姆林甜橙的出愈率在65～105 d呈下降趋势，在105 d达到最低值77.43%，从115 d开始上升至采样结束。同时培养基D对哈姆林甜橙未受精胚珠不同生长时期胚珠胚性愈伤组织的诱导在65～105 d呈上升趋势，在105 d达到最高值，为59.13%，105～145 d呈下降趋势。培养基E在75～105 d和125～135 d的诱导效果显著，这说明这两个时间段培养基E对哈姆林甜橙未受精胚珠有很好的愈伤诱导效果，但是对哈姆林甜橙各个时期的胚性愈伤组织的诱导效果不佳(图4)。综上，培养基A、E用于哈姆林甜橙未受精胚珠愈伤的诱导中，非胚性愈伤诱导效果显著。培养基B、C、D对哈姆林甜橙未受精胚珠胚性愈伤组织诱导效果有差异，培养基C、D的诱导效果要优于培养基B，若使用培养基C，则最佳采样时间为95 d，若使用培养基D，最佳采样时间为105 d。

图4 哈姆林甜橙在5种不同培养基的愈伤组织诱导情况

3 小结与结论

激素是组培中诱导愈伤组织的关键因子之一，本研究用未加激素的培养基诱导3个柑橘品种未受精胚珠的愈伤诱导效率较低，且不能获得胚性愈伤组织。6-BA对柑橘胚性愈伤的诱导有显著效果，培养基B、C、D中，随着6-BA的浓度逐渐升高，愈伤诱导效率在逐渐升高，但是培养基C、D之间效果相当，相差不大。Starrantino等[7]诱导甜橙胚性愈伤组织时发现，随着细胞分裂素的增加，胚性愈伤组织的诱导率也随之提高，认为这可能与成熟种子中ABA含量较高有关，因为种子中高浓度ABA需要赤霉素或高浓度的细胞分裂素与之相拮抗才能形成胚性愈伤组织。赣南早脐橙为纽荷尔脐橙芽变早熟品种，比目前主栽品种纽荷尔脐橙早熟30 d以上[8]，所以在相同采样时期赣南早脐橙比纽荷尔脐橙和哈姆林甜橙成熟度更高，且赣南早脐橙果实ABA含量出现峰值的时间早于纽荷尔脐橙，在115 d之前其ABA含量高于纽荷尔脐橙[9]，这可能就解释了为什么赣南早脐橙胚性愈伤诱导的6-BA最适浓度为7.50 mg·L-1，而纽荷尔脐橙为5 mg·L-1，且在相同的培养基和采样时期下哈姆林甜橙的最高胚性愈伤诱导率比赣南早脐橙高的原因。在禾本科植物胚性愈伤组织诱导过程中，2,4-D是很有效的激素，但是2,4-D诱导下3个柑橘品种的愈伤为非胚性的致密型愈伤组织，说明2,4-D在柑橘愈伤组织诱导中更利于致密的、非胚性的愈伤组织的形成，且Vardi等[10]认为，2,4-D还会导致愈伤组织染色体的变异。

一般来说幼嫩的胚珠比老的胚珠较容易诱导胚性愈伤组织，多胚品种比单胚品种诱导更为容易[11]，赣南早脐橙、纽荷尔脐橙、哈姆林甜橙都属于多胚品种。史文静等[12]发现，葡萄的胚珠离体培养时间在花后5～8周可以得到较好的效果。本研究3个品种在采样后期的愈伤诱导效果都不如采样中期，且最佳胚性愈伤诱导效果都集中在采样中期。

胚珠是体细胞再生的理想材料，为难以获得种子的植物提供育种新思路，王荣梅[13]以未受精胚珠为外植体对萱草科植物离体雌核进行培养发现诱导效果差异显著，诱导效果最佳可达66.67%。刘宝勇[14]在使用朱顶红的子房进行培养时获得了大量由胚珠发育而成的无菌苗。本研究通过甜橙未受精胚珠获得了大量的愈伤组织，为柑橘植株再生提供材料。研究筛选出了赣南早脐橙、纽荷尔脐橙、哈姆林甜橙未成熟胚珠的最佳愈伤诱导方案，其中赣南早脐橙使用培养基MT+7.50 mg·L-16-BA，在105 d进行采样；纽荷尔脐橙使用培养基MT+5.0 mg·L-16-BA且在95 d采样；哈姆林甜橙使用培养基MT+5.0 mg·L-16-BA在95 d采样，若使用培养基MT+7.50 mg·L-16-BA，则最佳采样时间为105 d。本研究建立了一个高效的甜橙胚性愈伤诱导体系，为进一步研究赣南早脐橙、纽荷尔脐橙、哈姆林甜橙未受精胚珠组织培养、脱毒保存及通过生物技术手段改良脐橙品种奠定基础。