6种芸香科药材的特征图谱及含量对比研究

王闽予，邓淙友，陈康梅，罗文安，陈万发，邱韵静，胡绮萍

（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东佛山 528244）

来源于芸香科植物的药材化橘红、个青皮、四花青皮、陈皮、枳实、枳壳等为临床常用中药，其中化橘红为芸香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’或柚Citrus grandis（L.）Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮；个青皮为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮，5~6月收集自落的幼果，晒干，习称“个青皮”，而7~8月采收未成熟的果实，在果皮上纵剖成四瓣至基部，除尽囊瓣，晒干，习称“四花青皮”；陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮；枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实，7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥；枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果，5～6月收集自落的果实，除去杂质，自中部横切为两半，晒干或低温干燥，较小者直接晒干或低温干燥［1］。

芸香科药材中含有的黄酮类成分以橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷为代表，不同品种间主要成分相似性较高，特别是橘属的青皮、个青皮、陈皮，以及橙属的枳壳、枳实，上述品种为同一植物的不同成熟期，其近似性更高，但不同药材的功效各有侧重，因此对这些品种进行对比研究，为其市场监管以及临床用药安全提供参考方法具有重要意义［2］。目前，对于该类药材的研究多见单味药材指纹图谱的研究［3-8］，以柚皮苷及橙皮苷作为含量测定的主要成分；未见有同一条件下对同属药材进行对比的研究报道。因此，本文通过UPLC技术对上述药材进行特征图谱和多指标含量测定研究，并结合相似度、聚类分析、主成分分析（principal component analysis,PCA）及偏最小二乘法-判别分析（partial least squares discrimination analysis,PLS-DA），比较常用芸香科药材的差异性，为芸香科药材的鉴别与质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters H-class型超高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Agilent SB C18（100 mm×2.1 mm,1.8 μm）；ME204E型万分之一分析天平和P26百万分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ500D数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q Direct型超纯水系统（美国默克公司）。

1.2 试药

柚皮苷（批号：110722-201714，质量分数：93.4%）、新橙皮苷（批号：111857-201804，质量分数：99.4%）、橙皮苷（批号：110721-201818，质量分数：96.20%）对照品由中国食品药品检定研究院提供；芸香柚皮苷（批号：wkq19041908，质量分数：98.0%）、水合橙皮内酯（批号：wkq20031904，质量分数：98.0%）、川陈皮素（批号：wkq20031701，质量分数：98.0%）、橘红素（批号：wkq16011401，质量分数：98.6%）对照品由四川维克奇生物科技有限公司提供；马尔敏对照品（批号：CFS201901，质量分数：98.0%）由Chem Face生物有限公司提供；甲醇为分析纯；磷酸、乙腈为色谱纯；水为超纯水。

药材经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定，H1~H11号样品为芸香科植物化州柚C.grandis的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，G1~G8号样品为芸香科植物橘C.reticulata及其栽培变种的干燥幼果，SH1~SH12号样品为芸香科植物橘C.reticulata及其栽培变种的干燥未成熟果实的果皮，C1~C7号样品为芸香科植物橘C.reticulata及其栽培变种的干燥成熟果皮，Z1~Z20号样品为芸香科植物酸橙C.aurantium及其栽培变种的干燥未成熟果实，ZS1~ZS12号样品芸香科植物酸橙C.aurantium及其栽培变种的干燥幼果。药材具体信息见表1。

表1 药材具体信息表Table 1 Specific information of Rutaceae Herbs

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0~7 min，15%→25%A；7~8 min，25%→40%A；8~10 min，40%→45%A；10~13 min，45%→60%A；13~15 min，60%→15%A）；流速为0.4 mL/min；柱温为30℃；检测波长为320 nm；进样量为1 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为16.930、90.094、11.080、31.729、3.459、1.127、2.197、2.564 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末（过三号筛）约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 特征图谱方法学研究

2.4.1 精密度试验 取同一批化橘红（批号：H3）和枳壳（批号：Z3），分别按“2.3”项方法制备供试品溶液和“2.1”项色谱条件连续进样6次，记录色谱图。分别以柚皮苷及橙皮苷为参照峰，计算各自共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一批化橘红（批号：H3）和枳壳（批号：Z3）供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”项色谱条件进样测定，记录色谱图。分别以柚皮苷及橙皮苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 分别取同一批化橘红（批号：H3）和枳壳（批号：Z3）样品粉末6份，按“2.3”项方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定，记录色谱图。分别以柚皮苷及橙皮苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明方法重复性良好。

2.5 特征图谱分析及评价

2.5.1 特征图谱的建立及共有峰归属 取70批样品，分别按“2.3”项方法制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件分析，将所得色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（国家药典委员会，2012.0版）进行结果分析，化橘红确定7个共有峰（见图1），个青皮确定9个共有峰（见图2），四花青皮共确定9个共有峰（见图3），陈皮确定7个共有峰（见图4），枳壳确定11个共有峰（见图5），枳实确定11个共有峰（见图6）。其中3号峰（橙皮苷）分离度较好，响应较高，为药材中抗炎、抗氧化、抗菌、保护心血管系统的主要成分之一［9］，故以3号峰（橙皮苷）为参照峰（即为S峰）；化橘红药材则以2号峰（柚皮苷）为参照峰。经与对照品色谱峰保留时间比对，并结合DAD光谱分析，共指认8个特征峰，峰1为芸香柚皮苷，峰2为柚皮苷，峰3为橙皮苷、峰4为新橙皮苷、峰5为水合橙皮内酯、峰9为马尔敏、峰10为川陈皮素、峰11为橘红素（见图7）。

图1 11批化橘红药材UPLC特征图谱共有峰Figure 1 UPLC characteristic spectrum common peaks of 11 batches of Exocarpium Citri Rubrum

图2 8批个青皮药材UPLC特征图谱共有峰Figure 2 UPLC characteristic spectrum common peaks of 8 batches of Fructus Citri Immaturi

图3 12批四花青皮药材UPLC特征图谱共有峰Figure 3 UPLC characteristic spectrum common peaks of 12 batches of Pericarpium Citri Reticulatae Viride

图4 7批陈皮药材UPLC特征图谱共有峰Figure 4 UPLC characteristic spectrum common peaks of 7 batches of Pericarpium Citri Reticulatae

图5 20批枳壳药材UPLC特征图谱共有峰Figure 5 UPLC characteristic spectrum common peaks of 20 batches of Fructus Aurantii

图6 12批枳实药材UPLC特征图谱共有峰Figure 6 UPLC characteristic spectrum common peaks of 12 batches of Fructus Aurantii Immaturus

图7 6种芸香科药材样品共有峰对照品归属图Figure 7 The chromatograms of common peaks of the refer‐ence substance in six kinds of Rutaceae Herbs samples

2.5.2 相似度评价结果 采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0版本）”分别对70批芸香科药材样品UPLC特征图谱数据处理分析，采用平均数，时间窗口为0.1，自动匹配，分别以枳实、枳壳、个青皮、四花青皮、陈皮、化橘红共有模式作为对照特征图谱，计算相似度系数，结果表明芸香科同一药材不同批次间的化学成分具有较好的一致性，结果见表2。

表2 6种不同品种药材样品相似度评价结果Table 2 Similarity evaluation results of six kinds of Rutaceae Herbs

2.5.3 不同品种药材UPLC特征图谱相似度比较分别将上述6种芸香科药材的对照图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0版本）”软件，结果显示，不同基原样品间指纹图谱共有峰信息和相似度均有差异，表明即使是同属的药材，化学成分亦存在着差异，见表3。

表3 6种不同品种药材对照特征图谱相似度评价结果Table 3 Similarity evaluation results of control characteristic chromatograms of six kinds of Rutaceae Herbs

2.5.4 聚类分析 运用SPSS 20.0软件对70批药材样品中16个共有峰的峰面积为数据进行系统聚类，采用Ward联结法，以Euclidean距离作为样品相似度的距离公式，分析结果见图8，当判断距离为5时，结果显示70批药材被分为4类：Ⅰ类包括H1~H11，即化橘红（柚的果实）为一类，Ⅱ类包括Z1~Z20，即枳壳（酸橙未成熟果实），Ⅲ类包括ZS1~ZS12，即枳实（酸橙干燥幼果），Ⅳ类包括G1~G8、SH1~SH12、CP1~CP7，即橘不同成熟期的果实（个青皮、四花青皮、陈皮）为一类。

图8 聚类分析结果Figure 8 Results of cluster analysis

2.5.5 主成分分析 以70批药材样品中的20个共有峰的峰面积数据，通过Graph Prism9软件对其进行主成分分析，得出相关矩阵的特征值和方差，见表4。结果显示，前4个主成分的累计方差贡献率达84.045%，故选择前4个主成分可代表化橘红、个青皮、四花青皮、陈皮、枳壳和枳实6种药材特征图谱共有峰的大部分信息。由初始因子载荷矩阵（表5）可知，第1主成分主要反映色谱峰10（川陈皮素）、峰11（橘红素）、峰18、峰19和峰20的信息，第2主成分主要反映色谱峰12、峰13的信息。通过计算各样品主成分得分（表6），不同品种之间主成分得分差异较明显，如化橘红的主成分2得分最高；个青皮、四花青皮、陈皮的主成分1得分较高；枳壳的主成分4得分最高；枳实的主成分得分则整体偏低；虽然主成分3及主成分4反映的色谱峰信息权重值占比较低，在二维图上不呈现，但柚、橘、酸橙3大类药材在主成分得分上仍存在明显差异。

表4 主成分特征值及贡献率Table 4 Principal component eigenvalue and contribution rate

表5 主要因子载荷矩阵Table 5 Main factor load matrix

表6 主成分得分Table 6 Principal component score

2.5.6 偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）主成分分析结果显示，不同成熟期的样品相似性较高，较难区分，本研究采用PLS-DA对不同成熟期的橘（个青皮、四花青皮、陈皮）以及酸橙（枳壳和枳实）进行分析。

所建立的橘（个青皮、四花青皮、陈皮）的模型，R2X（cum）=0.854，R2Y（cum）=0.929，Q2（cum）=0.894，均大于0.5，说明该模型稳定可靠，该模型可将不同成熟期橘的果实个青皮、四花青皮、陈皮样品分为3类；从10个变量的VIP值图，以VIP>1.0为显著影响，共找到4个差异标志物，其影响显著性排序为峰1（芸香柚皮苷）>峰3（橙皮苷）>峰4（新橙皮苷）>峰17，提示该几个化学成分对于区分不同成熟期橘的果实（个青皮、四花青皮、陈皮）贡献率较大，结果见图9。

图9 个青皮、四花青皮和陈皮的PLS-DA分析图Figure 9 PLS-DA analysis chart of Fructus Citri Immaturi，Pericarpium Citri Reticulatae Viride and Pericarpium Citri Reticulatae

所建立的酸橙（枳壳和枳实）的模型，R2X（cum）=0.751，R2Y（cum）=0.919，Q2（cum）=0.867，均大于0.5，说明该模型稳定可靠，该模型可将不同成熟期橘的果实枳壳、枳实样品分为2类；从11个变量的VIP值图可知，以VIP>1.0为显著影响，共找到5个差异标志物，其影响显著性排序为峰4（新橙皮苷）>峰2（柚皮苷）>峰9（马尔敏）>峰10（川陈皮素）>峰3（橙皮苷），提示这几个化学成分对于区分不同成熟期酸橙的果实（枳壳和枳实）贡献率较大，结果见图10。

图10 枳壳和枳实的PLS-DA分析图Figure 10 PLS-DA analysis chart of Fructus Aurantii and Fructus Aurantii Immaturus

2.6 多指标质量分数的测定

据文献报道，芸香科植物药材药效成分主要为黄酮类化合物，普遍具有理气健脾、化痰等相似功效［10-12］。因此，在进行特征图谱研究的同时选择黄酮类成分（芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）和脂溶性成分（水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素）作为质量控制指标，为该类药材的质量评价提供参考。

2.6.1 色谱条件 同“2.1”项。

2.6.2 供试品溶液的制备 同“2.3”项。

2.6.3 精密度试验 取枳壳供试品溶液（批号：Z3），按“2.6.1”项色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素峰面积的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.6.4 线性范围、检测限及定量限 精密称定芸香柚皮苷对照品3.403 mg、柚皮苷对照品5.512 mg、橙皮苷对照品2.306 mg、新橙皮苷对照品5.320 mg、水合橙皮内酯对照品0.706 mg、马尔敏对照品2.299 mg、川陈皮素对照品2.242 mg、橘红素对照品2.600 mg，加甲醇制成质量浓度分别为336.632 5、514.820 8、221.606 6、528.808 0、69.188 0、225.302 0、219.716 0、256.438 0 μg/mL的混合对照品溶液。分别加甲醇稀释制得7个不同质量浓度的对照品溶液，以质量浓度（μg/mL）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，得到各个对照品回归方程及线性范围。分别以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10的对照品浓度为检测限和定量限。结果见表7。

表7 回归方程及线性范围、检测限及定量限Table 7 Regression equations，linear range，LOD and LOQ

2.6.5 稳定性试验 取枳壳供试品溶液（批号：Z3），按“2.6.1”项色谱条件分别于0、2、4、6、8、12 h进样，记录峰面积，结果测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素峰面积的RSD均小于2%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.6.6 重复性试验 取枳壳样品6份（批号：Z3），按“2.6.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件进行测定，结果测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素质量分数的RSD均小于2%，表明测定方法重复性良好。

2.6.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的枳壳饮片（Z3）0.075 g，平行6份，加入与样品中含量等量的对照品，按“2.6.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件进行测定，计算加样回收率。结果见表8。

表8 （续）

表8 加样回收率试验结果Table 8 The results of recovery

2.6.8 质量分数测定结果 精密称取70批样品，按“2.6.2”项方法制备供试品溶液，按“2.6.1”项色谱条件进样测定，结果见图11。可见，芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素、橘红素5个成分可在橘（个青皮）及酸橙（枳壳和枳实）检出；橘（陈皮）可检出橙皮苷、川陈皮素、橘红素成分；橘（四花青皮）可检出芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素成分。

图11 6种芸香科药材各指标成分的质量分数占比图Figure 11 The proportion of each index content in 6 kinds of Rutaceae Herbs

3 讨论

本研究通过建立不同芸香科药材的特征图谱结合化学计量法对不同芸香科药材进行分析，结果显示同基原间的样品相似性较高，不同基原间的样品则差异性较大。通过聚类分析、主成分分析显示，不同成熟期样品存在部分批次交叉交集的情况，原因可能为不同采收期的样品仅在化学成分的量上有差异；进一步采用PLS-DA单独分析，可将同一基原中不同成熟期果实进行区分。结合上述分析结果，说明不同芸香科药材不同基原样品虽然主要成分近似，但由于包含的化学成分种类不一，可清晰的进行区分；而同基原的不同成熟期样品，其成分种类相似，差异多体现含量上，可结合化学计量法进行鉴别。

本文结果显示，芸香科植物药材不同基原8个化学成分比例具有差异性，柚（化橘红）中柚皮苷含量占比最高；橘（个青皮、四花青皮、陈皮）中橙皮苷含量占比最高，且橙皮苷含量均值从高到低为：个青皮>四花青皮>陈皮；酸橙（枳壳和枳实）均含有8个化学成分，柚皮苷及新橙皮苷含量占比较高，且枳实整体含量均高于枳壳。基于上述结果，推测不同芸香科药材中化学成分含量及种类具有一定的差异；且同一基原的药材，随着成熟度的增加，部分黄酮类成分含量整体呈下降趋势。本文研究结果与文献[10-12]报道的“临床药效表明陈皮的理气作用弱于青皮，枳壳的理气作用弱于枳实，原因可能与黄酮类成分的含量下降有关”相似。

本研究建立的UPLC特征图谱方法较全面地反映了芸香科药材的化学成分，并同法测定了已归属的8个特征性成分，分析方法迅速简便，利用聚类分析、主成分分析和偏最小二乘判别分析可以有效区分上述芸香科6种药材，且该6种药材含有的黄酮类成分组成及含量存在显著差异，为芸香科药材资源的进一步研究及质量控制提供了依据。