MiR-10b-3p通过靶向结合INHBA抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

张娜贤，刘柳，李刚，刘琳瑞，李元颖

（南阳市第二人民医院乳腺肿瘤科，河南南阳 473000）

乳腺癌是女性恶性肿瘤病死率最高的恶性肿瘤。随着现代生物分子诊断技术的飞速发展，乳腺癌的早期诊断与分子靶向治疗已取得了一定成果，但患者术后复发率及晚期患者预后仍不理想[1]。因此，深入分析乳腺癌的发生发展机制，探索新的分子靶点，对于乳腺癌的临床诊治有重要作用。研究显示，微小RNA（miRNAs）可结合靶基因3’非翻译区，调控其表达，参与恶性肿瘤的多种病理生理过程，发挥促癌或抑癌作用[2-3]。目前研究证实，miR-10b与乳腺癌[4]、肝癌[5]、结直肠癌[6]等多种恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移密切相关。miR-10b-3p作为miR-10b 3’端臂加工产生的miRNA，Canu等［7］研究显示，miR-10b-3p可靶向精子相关抗原5，影响乳腺癌细胞的增殖。抑制素β A（INHBA）是性腺分泌的水溶性蛋白，可形成抑制素和激活素，调控机体生殖和发育，与多种恶性肿瘤的发生发展有关[8]。前期经miRWalk在线软件预测miR-10b-3p靶基因为INHBA，但miR-10b-3p是否可靶向INHBA在乳腺癌中发挥作用尚不清楚。基于此，本研究将结合GEO、TCGA数据库，分析miR-10b-3p对乳腺癌增殖、迁移及侵袭的影响及其潜在机制，旨在为乳腺癌的临床诊断和靶向治疗提供新的靶点及依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株、动物及质粒来源

MCF-7和MDA-MB-231细胞株购自上海生命科学院细胞和生物化学研究所。16只雌性Balb/c裸鼠，6周龄，体质量18~22 g，购自南阳建兴实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（豫）2018-0005。miR-10b-3p质粒、INHBA质粒来自于优宝公司。

1.2 主要试剂与仪器

miR-10b-3p mimics及其阴性对照、pcDNA-INHBA（美国Ambion）；脂质体2000试剂盒、野生型及突变型INHBA荧光素酶报告基因载体（美国Invitrogen）；PrimeScript RT Reagent Kit逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqqRT-PCR试剂盒（日本TaKaRa）；引物序列由北京阅微基因技术有限公司提供；CCK8试剂盒（日本同仁）；Transwell小室、基质胶（美国BD）；β-actin、INHBA蛋白一抗（美国Cell Signaling Technology）；双荧光素酶活性检测试剂盒（北京艾然生物科技有限公司）；CFX96Touch实时荧光定量PCR仪、iMARK酶标仪（美国Bio-Rad）。

1.3 数据集的筛选与分析

下载GEO数据GSE45666乳腺癌相关数据矩阵，分析miR-10b-3p与乳腺癌发生发展关系；下载TCGA_BRCA乳腺癌数据矩阵和临床信息，以乳腺癌中INHBAmRNA表达水平的四分位数分组，将乳腺癌患者分为INHBA高（1/4）、低（3/4）表达两组，进行基因富集分析，观察INHBAmRNA表达水平与乳腺癌恶性临床表型的关系，利用R survival包分析INHBAmRNA在乳腺癌预后中的作用。

1.4 细胞传代培养与转染

将MCF-7、MDA-MB-231细胞于37℃水浴中快速解冻，800 r/min离心5 min，悬浮于含有10%（φ）胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37℃、5%（φ）CO2条件培养，待细胞密度达80%及以上时，按1∶3比例传代培养。取生长状态良好的细胞，参照脂质体2000试剂盒说明书操作，转染miR-10b-3p、质粒，并用G418筛选并构建稳定过表达miR-10b-3p的乳腺癌细胞系。在稳定过表达miR-10b-3p的乳腺癌细胞中转染INHBA质粒，记作miR-10b-3p+INHBA组。

1.5 实时荧光定量PCR检测miR-10b-3p、INHBA mRNA水平

收集转染后细胞，添加Trizol试剂提取总RNA，选取A260/A280为1.8~2.0样本，参照PrimeScript RT Reagent Kit逆转录试剂盒说明书操作，合成cDNA模板链，再经SYBR Premix Ex TaqqRT-PCR试剂盒，进行实时荧光定量PCR扩增。扩增条件为：95℃预变性2 min，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共38个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算miR-10b-3p、INHBAmRNA相对水平，引物序列见表1。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.6 CCK-8实验检测细胞增殖

将转染后细胞接种于96孔板，分别培养24、48、72、96、120 h后，向各孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h，用酶标仪检测450 nm下各组细胞吸光度（A值），以A值表示细胞增殖能力。

1.7 划痕实验检测细胞迁移

将转染后细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后，用200 μL移液枪头垂直于细胞孔板划痕，观察0 h和24 h时细胞的迁移情况，计算细胞迁移能力[(0 h划痕宽度−24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度]。

1.8 Transwell小室实验检测细胞侵袭

预先将基质胶包被Transwell小室上室，取转染后细胞接种于Transwell小室上室，加入无血清培养基，下室添加含有10%（φ）胎牛血清培养基，正常培养24 h后取出Transwell小室，弃去小室内培养液，轻轻拭去上室内细胞，结晶紫染色10 min，显微镜下进行细胞计数，实验孔侵袭细胞数/对照孔侵袭细胞数表示相对侵袭能力。

1.9 裸鼠荷瘤模型的建立及检测

将过表达miR-10b-3p的MCF-7细胞调整密度为1×107/mL，于裸鼠第二乳垫下注射0.2 mL，若接种部位出现肿瘤结节，即可认为裸鼠荷瘤模型构建成功。肉眼可见瘤体后，每隔2天测量瘤体体积，14 d时处死裸鼠，剥离瘤体称质量并测量体积，采用实时荧光定量PCR检测miR-10b-3p水平。

1.10 双荧光素酶报告基因检测miR-10b-3p的靶向基因

经miRWalk在线软件预测miR-10b-3p靶基因为INHBA，将野生型及突变型INHBA荧光素酶报告基因载体与miR-10b-3p mimics和阴性对照分别转染MCF-7、MDA-MB-231细胞，参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书操作，检测各组荧光素酶读数。

1.11 蛋白印迹检测INHBA蛋白表达

收集转染后细胞，添加RIPA裂解液提取总蛋白，测定蛋白浓度后，混入上样缓冲液，沸水浴蛋白变性10 min，取70 μg变性蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，再电转至PVDF膜，置于5%脱脂奶粉中，室温摇床封闭2 h，再加入1∶1 000稀释的蛋白一抗，4℃摇床孵育过夜，接着加入1∶8 000稀释的蛋白二抗工作液，37℃摇床孵育1 h，最后进行ECL化学发光。

1.12 统计学方法

采取统计学软件SPSS17.0分析处理数据，计量资料以均数±标准差（）表示，两两均数比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用χ2检验；采用受试者工作曲线描述miR-10b-3p、INHBAmRNA对乳腺癌的诊断价值，以曲线下面积（AUC）评价其诊断效能；生存分析采用Kaplan-Meier和Log-rank检验法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-10b-3p在乳腺癌临床组织中的表达及其意义

如图1，GEO数据集中，与癌旁对照组织比较，乳腺癌组织中miR-10b-3p水平降低（P<0.05）；miR-10b-3p对乳腺癌具有较高的诊断价值，AUC为0.998，95%CI为0.965~1.000；与临床分期Ⅰ期比较，Ⅱ~Ⅳ期患者miR-10b-3p水平降低（P<0.05）；与T1~T3期 比 较，T4期 患 者miR-10b-3p水 平 降 低（P<0.05）；与临床组织病理学分级G1~G2级比较，G3级患者miR-10b-3p水平降低（P<0.05）。

图1 miR-10b-3p在乳腺癌临床组织中的表达及其意义Figure 1 Expression and significance of miR-10b-3p in breast cancer tissues

2.2 INHBA mRNA在乳腺癌临床组织中的表达水平及其意义

如图2，TCGA数据集中，与癌旁正常组织比较，乳腺癌组织中INHBAmRNA水平升高（P<0.05）；INHBAmRNA水平对乳腺癌具有较高的诊断价 值，AUC为0.935，95%CI为0.920~0.948；不 同TNM分期乳腺癌患者中mRNA水平的比较，差异有统计学意义（P<0.05）；与N0期乳腺癌患者比较，N1期患者INHBAmRNA水平升高（P<0.05）；与预后良好乳腺癌患者比较，预后不良患者INHBAmRNA水平升高（P<0.05）；基因富集分析结果显示，细胞增殖、细胞迁移、肿瘤浸润及淋巴结转移基因集富集在INHBA高表达组；生存期分析显示，INHBA高表达乳腺癌患者总生存期明显低于INHBA低表达者（P<0.05）。

图2 INHBA mRNA在乳腺癌临床组织中的表达水平及其意义Figure 2 Expression and significance of INHBA mRNA in breast cancer tissues

2.3 过表达miR-10b-3p对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

如图3，与miR-NC组比较，miR-10b-3p组MCF-7、MDA-MB-231细胞中miR-10b-3p水平上调，细胞增殖能力、迁移率及侵袭能力均降低（P<0.05）。

图3 过表达miR-10b-3p对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响Figure 3 Effect of miR-10b-3p overexpression on the proliferation，migration and invasion of breast cancer cells

2.4 过表达miR-10b-3p对裸鼠肿瘤生长的影响

结果见图4，与miR-NC组比较，miR-10b-3p组裸鼠瘤体体积、质量均降低，miR-10b-3p水平升高（P<0.05）。

图4 过表达miR-10b-3p对裸鼠肿瘤生长的影响Figure 4 Effect of miR-10b-3p overexpression on tumor growth in nude mice

2.5 miR-10b-3p与INHBA的靶向关系

结果见图5，miR-10b-3p与INHBA3’非编翻译区存在结合位点，与对照组比较，共转染miR-10b-3p mimics、野生型INHBA荧光素酶报告基因载体组荧光素酶活性明显降低（P<0.05）；与miR-NC组比较，miR-10b-3p组INHBAmRNA及蛋白表达明显降低（P<0.05）。

图5 miR-10b-3p与INHBA的靶向关系Figure 5 Targeted relationship between miR-10b-3p and INHBA

2.6 miR-10b-3p靶向INHBA对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

如图6，与miR-10b-3p组比较，miR-10b-3p+INHBA组INHBA蛋白表达上调，细胞增殖能力、迁移率及侵袭能力均增加（P<0.05）

图6 miR-10b-3p靶向INHBA对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响Figure 6 Effect of miR-10b-3p on the proliferation,migration and invasion of breast cancer cells by targeting INHBA

3 讨论

近年来，乳腺癌的发病年龄呈年轻化趋势，严重影响患者生命安全，早期筛查乳腺癌对于改善患者预后尤为关键[9]。目前，乳腺癌的临床筛查仍缺乏血清学特异标记物，miRNAs有望成为乳腺癌的早期诊断分子[10]。miR-10b-3p是miRNAs家族成员之一，Guan等[11]研究结果显示，CMTM5是TCGA数据库中肝细胞癌的差异表达基因，miR-10b-3p与CMTM5存在靶向关系，miR-10b-3p过表达可靶向CMTM5促进肝细胞癌的增殖、侵袭和迁移能力。张超等[12]研究发现，miR-10b-3p可促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移，可能作为食管鳞癌基因治疗的潜在靶点。上述结果表明，miR-10b-3p在恶性肿瘤的调控中具有双重作用，可能介导不同靶基因的表达，在恶性肿瘤中发挥促癌或抑癌的作用。本研究通过分析GSE45666乳腺癌数据集，确定乳腺癌患者肿瘤组织中miR-10b-3p水平显著低于相应癌旁组织，提示miR-10b-3p可能在乳腺癌发挥抑癌作用。同时，miR-10b-3p对乳腺癌具有较高诊断价值，并在不同临床分级患者中存在差异表达，进一步表明miR-10b-3p是乳腺癌诊断的潜在生物标志物。

INHBA基因可编码βA亚基，通过形成抑制素和激活素，参与机体生殖、发育过程的调节[13]。越来越多的研究表明，INHBA在结肠癌[14]、胃癌[15]等恶性肿瘤中过表达，与患者临床预后相关。Liu等[16]对不同乳腺癌细胞系进行基因表达分析，发现INHBA是良性导管原位癌想侵袭型乳腺癌转变的关键调控因子，可能是潜在的预后指标。茅育蕾等[17]检测85例乳腺浸润性导管癌及35例癌旁乳腺组织中INHBA表达，结果显示，INHBA表达与乳腺浸润性导管癌患者肿瘤分化程度、淋巴结转移及KI-67增殖指数密切相关，可能参与乳腺癌的发生发展，可用于患者的预后评估。本研究选取TCGA数据集，发现促癌基因INHBA在乳腺癌芯片癌组织中表达上调，可用于乳腺癌的早期诊断、病情及预后的评估。基因富集分析结果显示，与细胞增殖、细胞迁移、肿瘤浸润及淋巴结转移相关的基因集均明显富集在INHBA高表达组，进一步证实INHBA作为促癌基因，参与乳腺癌的发生发展。

另外，本研究通过miRWalk在线软件预测miR-10b-3p靶基因为INHBA，且双荧光素酶报告基因检测显示，miR-10b-3p可特异性与INHBA3’非翻译区结合，靶向抑制INHBA的表达。构建miR-10b-3p过表达MCF-7和MDA-MB-231细胞系后，细胞增殖、迁移与侵袭能力明显减弱；同时，过表达miR-10b-3p的成瘤阳性裸鼠，瘤体生长也受到明显抑制。而INHBA过表达可逆转miR-10b-3p对乳腺癌细胞的抑制作用，提示乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力受到抑制的原因可能是miR-10b-3p直接靶向抑制INHBA，进而影响其下游基因的表达，诱导乳腺癌细胞产生上述细胞学行为。但乳腺癌的发生发展涉及多基因、多途径的共同调控，是否还有其他因素仍需要进一步探索研究。

综上所述，miR-10b-3p可能靶向调控INHBA，抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，这为转移性乳腺癌的靶向治疗提供了新思路，后续将深入分析miR-10b-3p在乳腺癌中的调控机制。