瑞马唑仑诱导对脓毒症小鼠免疫和肾上腺皮质功能的影响

孙加晓，郑娟娟，谢文钦

脓毒症是一种常见的、致命的疾病，其感染部位经常突破局部组织的限制，引起一系列生理反应失调，可迅速导致多器官功能障碍。目前，脓毒症还被定义为当细菌、病毒或真菌感染导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)时出现的一系列症状。因血管阻力降低常导致低血压(败血症休克)、多器官衰竭(严重脓毒症)和死亡[1-2]，病死率可高达28%～47%[3]，是重症监护病房的主要死亡原因[4]。

脓毒症可改变维持体内平衡的效应细胞寿命来影响免疫系统的功能[5]，通过产生一种持久的炎症和抗炎状态导致患者永久性的器官损伤和死亡[6]。术前麻醉药物的使用同时影响患者的免疫功能及病情预后[7]。依托咪酯是目前临床上常用的诱导药物，起效快，持续时间短，对血流动力学特性影响较小，对脓毒症患者免疫功能有一定保护作用[8]。但其可抑制肾上腺皮质功能，可能增加患者术后30 d死亡率、心血管发病率和长期住院的风险[9]。因此，对于脓毒症患者使用依托咪酯仍需慎重。瑞马唑仑是一种新型水溶性超短效静脉镇静剂[10]，该药起效时间短、麻醉效果强且对心血管影响较小，常被用于麻醉诱导和状态维持[11-12]。本研究通过比较依托咪酯和瑞马唑仑诱导对脓毒症小鼠模型的免疫功能和肾上腺皮肤功能的影响，探讨适用于脓毒症患者诱导的麻醉药物。

1 对象与方法

1.1 对象 清洁级实验BALB/C小鼠64只，雄性，体质量(20±2)g[批号：SCXK(川)2020-030，华西医院动物中心]，动物批次、年龄、饲养环境条件控制在同一基线水平。

1.2 分组 通过随机区组设计，将小鼠分为空白对照组(N组)、脓毒症组(S组)、瑞马唑仑组(R组)及依托咪酯组(E组)，每组样本量为16只。

1.3 方法 实验前动物自由饮水，禁食12 h。实验当天S组、R组和E组采用腹腔内注射脂多糖20 mg/kg(批号：L3242，美国Sigma公司)创建脓毒症动物模型。N组注射等剂量的生理盐水。动物出现以下症状判定为模型建立成功：呼吸频率加快、全身寒战，抱团取暖、拒绝饮食、活动度下降、抓取时无力逃避，毛发失去光泽、耸立且凌乱、排出稀水样粪便。当出现症状时记为开始时间，开始时间30 min后尾静脉注射药物干预：R组给予瑞马唑仑6 mg/kg(批号:200205AK，江西恒瑞医药股份有限公司)，E组给予依托咪酯8 mg/kg(批号：H32022999，江苏恩华药业股份有限公司)(R组和E组给药剂量为预实验测得脓毒症动物翻正反射消失的ED90)，N组和S组给予等剂量生理盐水。每组分别于注射后1 h和8 h后各取8只小鼠，采用摘除眼球取血法采集动物血液标本。收集2 mL血液，4 000 r/min 离心10 min，取上清，置于-20 ℃冰箱待测。用流式细胞术评估自然杀伤(nature killer cell, NK)细胞、CD3+、CD4+和CD8+的百分比和CD4+/CD8+水平。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)和皮质酮(cortisol，Cor)的含量，操作方法严格参照说明书。

2 结 果

2.1 注射后1、8 h时外周血各淋巴亚群比较 注射后1 h，4 组外周血CD3+、CD4+和CD8+3项指标比较，N组最高，S组最低，R组高于E组，差别有统计学意义(P<0.05)；4组间CD4+/CD8+、NK细胞比较，N组最高，S组最低，差别有统计学意义(P<0.05)，但R组与E组差别无统计学意义(P>0.05)。8 h时，4组外周血CD4+指标比较，N组最高，S组最低，R组低于E组，差别有统计学意义(P<0.05)；4组间CD3+、CD8+和NK细胞3项指标比较，N组最高，S组最低，差别有统计学意义(P<0.05)，但R组与E组差别无统计学意义(P>0.05)；N组CD4+/CD8+最高，S组、R组与E组差别无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 各组小鼠外周血淋巴亚群比较

2.2 注射后1、8 h血浆中细胞因子含量比较 与N组比较，S组血清的IL-6浓度在1、8 h时均明显上升，而IL-10浓度明显下降(P<0.05)；R组和E组的血清IL-6浓度在1、8 h均明显下降(P<0.05)，而IL-10浓度均明显上升(P<0.05)；1 h 时，R组血清IL-6浓度明显低于E组(P<0.05)，IL-10浓度明显高于E组(P<0.05)；8 h时，R组及E组血清IL-6、IL-10浓度比较，差别无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 各组小鼠血浆中细胞因子含量比较

2.3 注射后1、8 h时血浆中ACTH和Cor含量比较 注射后1、8 h时，各组小鼠的ACTH和Cor含量比较，N组最低，S组、R组均高于E组(P<0.05)；而S组和R组的ACTH、Cor含量比较，差别无统计学意义(P>0.05，表3)。

表3 各组小鼠血浆中ACTH和Cor含量比较

3 讨 论

脓毒症是一种病因复杂的全身炎症反应综合征。临床脓毒症危重患者常见的死亡原因为组织灌注不够、器官功能紊乱或严重低血压等[13]。相关研究指出，机体炎症反应的调节状态是脓毒症转归的关键，但脓毒症患者辅助性T细胞全面失衡，大量T细胞凋亡和巨噬细胞功能紊乱可能加速患者病情的进展[14]。

本研究采用小鼠脓毒症内毒素模型作为研究对象[15-16]。一般认为，动物出现以下症状判定为模型建立成功：呼吸频率加快、全身寒战，抱团取暖、拒绝饮食、活动度下降、抓取时无力逃避，毛发失去光泽、耸立且凌乱、排出稀水样粪便。随着小鼠脓毒症模型的建立成功，与N组比较，S组、R组和E组外周血各淋巴亚群下降明显，机体免疫功能可能出现异常抑制，免疫细胞出现大量凋亡。与S组比较，R组、E组外周血各淋巴亚群的百分比有较高的回升，说明两个药物对免疫功能有一定的保护作用。而R组、E组CD3+、CD4+和CD8+淋巴亚群的百分比在注射后1 h差别明显，但8 h时差别无统计学意义(P>0.05)，说明瑞马唑仑对免疫功能的保护作用在短时间内较为突出，但时间并不持久，具体持续时间仍需进一步研究。CD4+水平的下降可能是机体免疫功能受到抑制、免疫细胞大量凋亡的结果；而CD8+水平升高说明机体的免疫功能好转。与S组比较，R组、E组的CD8+百分比有所提升，说明脓毒症小鼠免疫功能有好转的趋势，这与戚振红等的研究相符[17]。多器官功能障碍综合症的独立危险因素是CD4+/CD8+比值下降，代表着机体存在较强的免疫抑制[18]。随着免疫研究领域的进步，NK细胞被认为是充当复杂的免疫系统的监管机构[19]；脓毒症中的NK细胞大量降低[20]。NK细胞的活化可以通过抑制细菌生长，保护机体免受肺炎的攻击，对败血症结果产生重大影响[21]。本研究中，S组、R组和E组的NK细胞均表现出不同程度下降，表明免疫功能受到不同程度损伤，而R组和E组的抑制程度较小。

IL-6是细胞因子连锁反应的标志，一定程度上反映了炎症和疾病严重程度的关系。作为一个促炎因子，IL-6可以作为判断脓毒症预后的一个重要指标[22]。IL-10是抗炎介质，可以抑制各种炎症因子的产生，其特殊生理意义在于能够局限和防止免疫功能的过度应答从而限制附带损害，在免疫表达中起到保护效果[23]。本研究脓毒症模型中，瑞马唑仑和依托咪酯对免疫功能有保护作用，在短时间内(1 h)瑞马唑仑的保护效果表现得更为明显。

正常状态下，机体分泌皮质醇由ACTH调节，而ACTH则由下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)调节，皮质醇反过来对以上两种激素反馈抑制[24]。目前的证据表明，脓毒症患者较高的死亡率与肾上腺皮质功能不全密切相关[25]。依托咪酯是临床上较常用的静脉麻醉药，因其对循环系统无不良影响，常用于危重患者的麻醉诱导[26]，但其对肾上腺功能有显著抑制作用[27]，可能增加患者术后30 d的死亡率、心血管发病率及长期住院的风险[9]；也有研究显示，依托咪酯会增加脓毒症患者的死亡率[28]。因此，对于脓毒症患者，仍需慎用依托咪酯。本研究中，依托咪酯也表现较大的肾上腺皮质功能抑制效果；而瑞马唑仑用于诱导时表现出与依托咪酯接近的免疫保护作用，但对肾上腺皮质功能无显著影响。因此，瑞马唑仑可能更适用于危重患者麻醉诱导。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究只监测了脓毒症小鼠1、8 h两个时间点，无法得知药物对免疫功能的持续作用时间；其次，未监测各组小鼠的血流动力学波动，无法得知瑞马唑仑是否可能造成脓毒症小鼠的血流动力学波动。瑞马唑仑是否会对危重患者的近期或远期转归有更好的收益，仍需进一步研究。