甲烷发酵与碱液对碱溶酸析法提取泥炭黄腐酸光谱学变化特征的影响

王震平，路亚楠，邓雅卉，马力通，2

(1.内蒙古科技大学 化学与化工学院，内蒙古 包头 014010；2.生物煤化工综合利用内蒙古自治区工程研究中心，内蒙古 包头 014010)

我国泥炭资源极其丰富，但其空间分布不均衡[1]。目前我国泥炭主要作为一种能源矿产，简单处理后供给园艺、肥料等领域[2]。谌佳伟等[3]研究发现，在微生物作用下，神农架大九湖泥炭湿地持续产出甲烷，CH4的年总排放量达5.57 g/m2，日平均排放速率10.96 nmol/(m2·s)。郝思雯等[4]研究发现，添加稀土化合物有助于提高微生物的活性，促进甲烷发酵过程，增大甲烷产量。

腐植酸(HA)是一类结构复杂的芳香羧酸化合物[5]。黄腐酸(FA) 是腐植酸中既溶于酸又溶于碱的组分，其分子量较小，溶解度较好，生物活性较高，含氧官能团较多[6]。张远琴等[7]采用焦磷酸钠溶液作溶剂，探索了浓度、反应时间和反应温度对腐植酸提取率的影响，最优工艺条件为：焦磷酸钠溶液浓度为0.03 mol/L，96 ℃下反应1.6 h，提取率达95.68%。

本文联合甲烷发酵与提取黄腐酸，探索不同碱液与甲烷发酵对黄腐酸的产率、纯度以及结构的影响，尝试揭示不同来源黄腐酸间的差异，希望进一步了解甲烷发酵与黄腐酸提取的结合机制，使泥炭资源得到充分利用。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

草本泥炭，来自吉林吉祥泥炭有限公司；活性污泥，由包头南郊的污水处理厂提供；黄腐酸，色谱纯；氢氧化钠、碳酸钠、NaHCO3、氨水、硫酸、亚硫酸钠、硫酸亚铁铵、重铬酸钾等均为分析纯。

AMPTS Ⅱ自动甲烷潜力测试系统；RX1傅里叶变换红外光谱仪；CAYR 5000紫外可见近红外分光光度计；LS55荧光发光光谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 泥炭甲烷发酵 将40 g 100目草本泥炭与3%的氢氧化钠溶液(固液比为1∶12)混合，70 ℃水浴加热110 min。调节pH于6.9～7.1范围内，加入活性污泥，进行厌氧发酵，直至日产气量降至 0 mL 停止发酵，同时做空白实验。泥炭发酵后过滤，取发酵残余物，提取黄腐酸。

1.2.2 黄腐酸的提取 取等量的烘干泥炭发酵残余物，加入5%的亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水浸泡24 h，固液比(g/mL)为1∶4。加入20倍体积蒸馏水，80 ℃加热搅拌2 h。离心取上清液，采用5% 硫酸溶液调节pH至2～3，再次离心，取上清液，测定黄腐酸含量，计算黄腐酸的产率。

(1)

式中V——提取的黄腐酸溶液总体积，mL；

B——提取的黄腐酸溶液浓度，g/mL；

m——提取黄腐酸所用泥炭的质量，g。

1.3 分析方法

1.3.1 黄腐酸含量测定 移取1.00 mL上清液于100 mL锥形瓶中，依次加入5.00 mL浓度0.4 mol/L重铬酸钾、15 mL浓硫酸，置于沸水浴中，加热氧化30 min，冷却至室温后，加入3～5 d邻菲罗啉指示液，采用硫酸亚铁铵滴定，溶液由橙色经绿色变为砖红色[8]，记录消耗硫酸亚铁铵体积，同时作空白实验。

(2)

式中B——黄腐酸含量，g/mL；

0.003——碳的毫克当量，g；

V0——滴定空白时消耗硫酸亚铁铵的体积，mL；

V1——滴定样品时消耗硫酸亚铁铵的体积，mL；

N——硫酸亚铁铵的摩尔浓度，mol/L；

C——腐植酸含碳比的换算系数(腐植酸为0.58，黄腐酸为0.54)；

V——样品体积，mL。

1.3.2 紫外可见光谱分析[8]将1 g黄腐酸样品溶解于100 mL碳酸氢钠溶液中，用0.1 mol/L的盐酸或1%的氢氧化钠调节pH为8.0。使用紫外全波长扫描仪扫描范围为200～800 nm。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱分析[9]称取1 mg烘干的黄腐酸样品，用傅里叶红外光谱仪测定红外光谱。

1.3.4 荧光光谱分析 将1 g黄腐酸样品溶解于100 mL碳酸氢钠溶液中，用0.1 mol/L的盐酸或1%的氢氧化钠调节pH为8.0。用荧光光谱仪扫描，激发波长为274 nm，狭缝宽度8 nm，扫描速度 1 000 nm/min，扫描范围275～650 nm。

2 结果与讨论

2.1 氢氧化钠预处理发酵后对甲烷产气的影响

NaOH预处理对CH4产气的影响见图1。

图1 总产气量

由图1可知，添加NaOH后，泥炭生物甲烷化总产气量明显提升。空白组总产气量为2 349.8 mL。在NaOH添加体系中，碱处理发酵组总产气量为 2 638.9 mL，增加了12.3%。这是因为一定浓度的Na+能改变细胞膜的通透性[10]，使微生物更易吸收和利用泥炭的营养物质，致产气量增加。表明泥炭甲烷化前用氢氧化钠预处理泥炭，有利于泥炭生物甲烷化。

2.2 碱液对碱溶酸析法提取泥炭黄腐酸的纯度及产率的影响

氢氧化钠预处理对微生物甲烷发酵过程及黄腐酸提取的影响见表1。

表1 黄腐酸的产率及浓度

由表1还可知，经碱预处理后，黄腐酸产率明显下降，由Na2SO3、Na2CO3、NaHCO3和NH3·H2O溶解泥炭得到的黄腐酸产率分别下降了 8.32%，17.2%，5.6%，27.1%。表明用氢氧化钠预处理泥炭发酵可消耗利用更多的黄腐酸，促进发酵过程。不同碱液对碱溶酸析法提取泥炭的黄腐酸产率有明显差异，使用亚硫酸钠获得的黄腐酸产率最高，黄腐酸产率下降率较低，为提取高产率黄腐酸的最优碱液。

由表1可知，提取所采用的碱液对黄腐酸的浓度有一定程度的影响，采用氨水提取黄腐酸的浓度较高，直接甲烷发酵采用氨水处理的黄腐酸浓度达1.02 g/L；采用碳酸氢钠获得的黄腐酸的浓度较低，为0.68 g/L；提取黄腐酸浓度较高的亚硫酸钠的黄腐酸浓度为0.83 g/L，仅次于氨水提取的，且其价格较为低廉，故为提取黄腐酸的最优碱液。

2.3 碱液对碱溶酸析法提取泥炭黄腐酸的红外光谱的影响

黄腐酸的红外光谱见图2。

图2 黄腐酸的红外谱图

经氢氧化钠预处理发酵后，在3 700～3 200 cm-1范围内，3 700～3 610 cm-1空白组高于碱处理发酵组；3 500～3 250 cm-1碱处理发酵组高于空白组，表明碱处理发酵后，黄腐酸的羟基减少而氨基增多。在2 924，1 680，1 560 cm-1附近，碱处理发酵组吸收峰强度高于空白组，表明碱处理发酵后，黄腐酸的亚甲基、羰基、苯环均增多。碱处理泥炭可以促进甲烷发酵过程，致使微生物更活跃，消耗更多的羟基等简单结构，而苯环等复杂结构无法被消耗。

2.4 碱液对碱溶酸析法提取泥炭黄腐酸的紫外光谱的影响

黄腐酸紫外可见光谱见图3。

由图3可知，在210～240 nm出现1～2个吸收峰，不同方法获得的黄腐酸的紫外谱图吸收峰在200～800 nm随波长的增大先增大后逐渐趋于0。黄腐酸在短波位置吸收强且随着波长的增大而减小，是因为黄腐酸是一种高度不饱和的芳香化合物，使得黄腐酸在紫外区的吸收较强。在280 nm附近出现强吸收且在260～330 nm范围内会出现吸收平台，表明黄腐酸具有芳香结构。

图3 黄腐酸的紫外可见图谱

E4/E6是研究黄腐酸结构的一个重要指标，E4、E6分别是465，665 nm处的吸光度值，可以反应黄腐酸分子的分子量的大小，与E4/E6的比值呈负相关趋势，即比值越大分子量越小[14]。见图4，空白组NH3·H2O得到的黄腐酸E4/E6最大为1.94；用碳酸氢钠获得的黄腐酸的E4/E6为1.48，为最小值，用氨水溶解获得黄腐酸分子量较小，用碳酸氢钠获得的分子量较大。

图4 黄腐酸的E4/E6

经氢氧化钠预处理发酵后得到的黄腐酸E4/E6明显增大，氨水获得的黄腐酸E4/E6比值达3.11，比将泥炭直接甲烷发酵后提取的黄腐酸提高 60.3%，经氢氧化钠预处理发酵后黄腐酸的分子量均下降，表明氢氧化钠预处理可以促进甲烷发酵过程，更多的黄腐酸被微生物利用、消耗，生成更多的甲烷，这与记录的总产气量结果吻合。

2.5 碱液对碱溶酸析法提取泥炭黄腐酸的荧光光谱的影响

由图5可知，黄腐酸荧光光谱均在400～450 nm处有吸收峰，栗婷婷等研究表明，在310～550 nm的荧光峰为类富里酸和类腐植酸物质[15]。由于黄腐酸结构复杂，含有多种不饱和基团，使其产生的吸收峰相互交叠，形成见图5的光谱。

图5 黄腐酸的荧光光谱

相比黄腐酸标准品的荧光光谱，不同方法的黄腐酸的最大出峰位置均发生蓝移，1-Na2SO3、1-Na2CO3、1-NaHCO3和1-NH3·H2O的最大峰位置分别由标准品的432 nm蓝移至420，419，415，414 nm 处。表明不同方法获得的黄腐酸结构不完全相同，分子不饱和基团的种类和数量上有差别。根据Li等[16]研究，有机质中芳构化程度高的稠环等的存在，会导致最大荧光峰发生红移。可推测发酵过程中黄腐酸部分被微生物消耗利用，芳构化程度降低，最大荧光峰蓝移。

3 结论

(1)在NaOH添加体系中碱处理发酵组总产气量相比于空白组增加了12.3%，由Na2SO3、Na2CO3、NaHCO3和NH3·H2O溶解泥炭得到的黄腐酸产率分别下降了8.32%，17.2%，5.6%，27.1%，表明用氢氧化钠预处理泥炭发酵可消耗利用更多的黄腐酸，促进发酵过程，生成更多的甲烷。亚硫酸钠提取黄腐酸产量、浓度均较高，且其价格较为低廉，故为提取黄腐酸的最优碱液。

(2)碱处理发酵后，黄腐酸的羟基减少，氨基、亚甲基、羰基、苯环增多。氨水、亚硫酸钠溶解获得黄腐酸有较多的羟基、羰基、苯环，而碳酸钠溶解得到的黄腐酸各种官能团含量都处于较低水平。

(3)紫外-可见光谱表明，黄腐酸分子芳构化程度较高。从氨水溶解获得黄腐酸分子量较小，由碳酸氢钠获得的黄腐酸分子量较大。经氢氧化钠预处理发酵后得到的黄腐酸E4/E6明显增大，经氢氧化钠预处理发酵后黄腐酸的分子量均下降。

(4)不同方法获得的黄腐酸结构不完全相同，分子不饱和基团的种类和数量上有差别，发酵过程中黄腐酸部分被微生物消耗利用，芳构化程度降低。