添加甘蔗糖蜜对湖泊红球藻及其虾青素合成的影响

韩玉莹，林港华，代容春，杨赐珠，薛婷，陈由强，何文锦

（1.福建师范大学生命科学学院，福州 350117；2.福建师范大学南方海洋研究院，福州 350117）

0 引言

海洋微藻已被作为各类生物反应器广泛研究，用于合成高价值的天然活性化合物，包括天然色素、天然多不饱和脂肪酸和活性蛋白质等[1-3]。湖泊红球藻（Haematococcus lacustris,H.lacustris）是绿藻门红球藻属的淡水单细胞微藻，生活史可分为营养生长期、包囊期、成熟期和萌发期。光照40µmol/(m2·s)、pH=8.8、生长温度(20±1)℃是湖泊红球藻最佳生长条件[4]；它还是一种光敏性微藻，在强光照射及其他胁迫条件下易积累虾青素，提高自身抗逆能力，并可作为天然虾青素的来源，具有很好的发展前景。

虾青素是广泛存在于自然界中的类胡萝卜素含氧衍生物，分子式C40H52O4，分子结构中含有共轭双键及不饱和酮基、羟基，因此极易与自由基反应进而清除自由基，具有很强的抗氧化性。除此之外，天然虾青素还具有抗炎、抗癌和抗增殖作用，可提高常规化疗药物在皮下肿瘤细胞中的效率。虾青素纯品为暗红棕色粉末，易溶于二氯甲烷、丙酮等多种有机溶剂[5-7]。当今市场中虾青素主要来源于天然产物的提取和人工化学合成两种途径，其中化学合成为主要生产方式，但化学合成的虾青素在抗氧化活性与稳定性较差且生物安全性低[8]。所以人工合成的虾青素尚未被批准作为食品添加剂直接用于人类使用[9]。绿藻门的湖泊红球藻被认为是自然界中生产天然虾青素最好的生物之一，其虾青素含量高，且以左旋结构为主，可很好地发挥其生物功效[10]。海洋微藻合成的天然虾青素安全性高，应用范围广，需求量大，可被用于化妆品、保健品等领域。

BG11培养基是一种应用比较广泛的淡水藻培养基，通常用来培养淡水蓝藻、绿藻和原生动物，适用范围广泛。通常情况下，培养基未添加碳源，可根据不同海藻的习性特点，添加适合的碳源以促进其生长。

甘蔗糖蜜是制糖工业将压榨出的甘蔗汁液，经加热、中和、沉淀、过滤、浓缩、结晶等制糖工序后剩下的黑褐色浓稠液体，是制糖业的副产品之一。甘蔗糖蜜组分多样，营养丰富，含有大量的发酵糖（蔗糖），还含有丰富的生物素、有机酸及各种矿质元素，可制作饲料添加剂、充当发酵辅料，也可作为微生物培养基的复合碳源等[11-15]。利用糖蜜进行微藻的培养，相较于葡萄糖等来说，可以大幅度降低成本；同时废物利用，不但绿色环保，更具有良好的生态环境效益[16-18]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

湖泊红球藻藻种H5 购于武汉水生所，经纯化鉴定，保种于本实验室。糖蜜购自广西柳州市金黔湾糖蜜有限公司。高效液相色谱仪HPLC 2695，Sun Fire C18250×4.6/5µm（18600 2560）色谱柱以及配套保护柱，购自美国Waters公司。

1.2 试验方法

1.2.1 糖蜜预处理

糖蜜为深褐色粘稠半流动液体，需要对糖蜜进行预处理，预处理方法参照陈建楠甘蔗糖蜜预处理方法[19]。预处理后糖蜜溶液为浅褐色液体，对吸光值测定有影响，测定前将其稀释至10-4接近无色。通过紫外分光光度计测定470 nm波长时的吸光值，依据标准曲线，计算出糖蜜溶液的总糖含量。

1.2.2 苯酚硫酸定糖法测定糖蜜总糖含量

采用苯酚-硫酸法制备葡萄糖溶液标准曲线，设置20、40、60、80、100µg/mL 五个浓度梯度，通过紫外分光光度计，分别检测每个浓度的3组样品，在波长为470 nm时的吸光值，得到线性方程：

1.2.3 藻种培养

第一阶段：正常光照下湖泊红球藻的生长扩繁培养阶段。对照组为BG11 培养基培养，每天摇瓶2 次。培养条件：光照强度40µmol/(m2·s)，温度（20±1）℃，光照周期12 h∶12 h，每组6个重复。试验组为在BG11培养基中分别添加总糖含量为0.5、1、1.5 g/L 的糖蜜（TM）或葡萄糖（G）进行培养，每天摇瓶2 次。培养条件同对照组一致。每组6 个重复。第二阶段：高光条件湖泊红球藻积累虾青素培养阶段。当湖泊红球藻进入快速生长时期，将对照组与试验组的每一浓度3 个重复，转移至高光下，培养条件：光照强度150µmol/(m2·s)，温度（20±1）℃，光照周期12 h∶12 h，每天摇瓶2次。

1.2.4 湖泊红球藻细胞密度与干重测定

利用血球计数板计算湖泊红球藻细胞密度。先称量10 mL 离心管的管重，在超净台中准确吸取10 mL均匀的湖泊红球藻培养液至称量好管重的离心管中，4 ℃、8 000 r/min，离心10 min，用蒸馏水洗涤2 次，离心后弃上清，先置于-80 ℃12 h，再冷冻干燥48 h，称量此时离心管重量，得出湖泊红球藻干重。

1.2.5 虾青素的提取与检测

利用HPLC对1、2、5、10、20 μg/mL五个浓度梯度的虾青素标准品溶液进行检测，得到线性方程：

湖泊红球藻虾青素的提取方法参考国标GB/T 31520-2015[20]。检测虾青素的高效液相色谱条件参数为：检测器PDA；流动相甲醇∶去离子水＝95∶5（V∶V），超声波脱气；流速1 mL/min;检测波长474 nm；进样量20 μL；柱温25 ℃。

目前,我国老年脑梗塞患者比较普遍,其作为脑血管病症中常见一种,导致其发病因素为脑组织缺血缺氧、脑部血流供应障碍而引发的有关脑部供血区域出现坏死、软化,进而致使神经功能损伤,该疾病的发病率和死亡率较高,一旦未及时进行治疗,则会导致患者留下后遗症,影响其身体健康和生活质量[1]。本文研究选取本社区的60例老年脑梗塞患者,对其分别采取单一舒血宁和依达拉奉并用方式,探究其治疗成效。现将详细探究内容进行如下报告。

2 结果与分析

2.1 外源添加糖蜜或葡萄糖的培养基对湖泊红球藻细胞生长的影响

在正常光照强度40µmol/(m2·s)，培养至45 d时，对照组藻细胞生长量达到最大，为8.44×106个/mL，而添加0.5 g/L糖蜜或葡萄糖试验组的藻细胞在培养至45 d时，藻细胞生长量达到最大，分别为8.90×106个/mL和9.44×106个/mL。从图1A 可见，与对照组相比，糖蜜或葡萄糖试验组都对湖泊红球藻的生长有显著的促进作用，不但可获得更高的藻细胞生长量，也有更长的藻细胞增殖期。不同总糖浓度的糖蜜或葡萄糖试验组中，低糖浓度培养基也都比高糖浓度培养基更有利于湖泊红球藻的生长，能获得更高的藻细胞密度。相同总糖浓度的葡萄糖培养基比糖蜜培养基更有利于促进藻细胞的增殖。

图1 正常光照强度（A）和高光照强度（B）下不同浓度糖蜜或葡萄糖对湖泊红球藻细胞密度的影响Fig.1 Effects of different concentrations of molasses or glucose on the cell density of H.lacustris under normal light intensity(A)and high light stress(B)

2.2 高光胁迫下不同浓度糖蜜或葡萄糖的培养基对湖泊红球藻细胞密度的影响

在150µmol/(m2·s)高光照强度培养下，对照组和试验组的藻细胞密度呈现基本稳定不再快速增长状态，并逐渐衰亡。图1B 显示高光培养条件不适合湖泊红球藻生物量的增长，而且会抑制藻细胞的生长。从图1B可见，与对照组相比，添加糖蜜或葡萄糖培养基，都比对照组更有利于维持藻细胞的活性。不同总糖浓度的糖蜜或葡萄糖培养基，低糖浓度培养基也都比同组的高糖浓度培养基更有利于维持藻细胞活性。由此可知，高光培养条件不利于藻细胞增殖生长，藻细胞比正常培养条件更早进入衰亡期。

2.3 不同浓度糖蜜或葡萄糖的培养基对湖泊红球藻合成虾青素的影响

在高光照150µmol/(m2·s)培养的第20 d、25 d 和30 d，总糖0.5 g/L 的糖蜜培养基培养下湖泊红球藻细胞的虾青素含量分别为10.04 mg/L、12.62 mg/L 和11.88 mg/L，显著高于对照组和相同总糖浓度的葡萄糖试验组（如图2A），分别是对照组的1.38 倍、1.82 倍和1.86 倍，分别是相同浓度葡萄糖培养基的1.66 倍、2.06 倍和1.33 倍。由此可见，添加低浓度糖蜜作为碳源有利于湖泊红球藻虾青素的积累，结合藻细胞生长情况分析，低浓度糖蜜培养基既有利于维持藻细胞活性，又有利于藻细胞中虾青素的积累。为获得较高含量的虾青素，可在糖蜜浓度0.5 g/L的培养基培养第25 d进行提取。

2.4 添加不同浓度糖蜜或葡萄糖的培养基对湖泊红球藻干重的影响

在光照150µmol/(m2·s)培养的第20 d、25 d 和30 d，总糖0.5 g/L的糖蜜培养基培养下的湖泊红球藻细胞干重为16.8 mg/L、28.3 mg/L和30.8 mg/L（如图2B），分别是对照组的1.14 倍、1.31 倍和1.81倍。就总体趋势而言，总糖0.5 g/L 的糖蜜培养基培养下的细胞干重显著高于对照组和相同浓度的葡萄糖培养基，分别是相同浓度葡萄糖培养基培养下藻细胞干重的0.99 倍、1.39 倍和1.80 倍。可见添加低浓度糖蜜为碳源有利于增加湖泊红球藻的细胞干重。

图2 不同浓度糖蜜或葡萄糖对湖泊红球藻虾青素含量（A）及湖泊红球藻干重（B）的影响Fig.2 Effects of different concentrations of molasses or glucose on astaxanthin content(A)and dry eight(B)of H.lacustris

3 讨论与结论

湖泊红球藻是一种光合自养，能合成天然强抗氧化活性物质——虾青素的淡水单细胞绿藻。本试验以BG11 培养基为对照组，以在BG11 培养基中添加糖蜜或葡萄糖为试验组培养湖泊红球藻，研究不同培养条件对湖泊红球藻细胞生长及代谢活性物质——虾青素积累的影响。经试验发现，培养基添加糖蜜或葡萄糖低浓度碳源，有利于促进湖泊红球藻细胞的增殖，生长速率加快，生物量得到显著提高。该结果与前人试验所得结论相似[21]，同样具有参考价值。我们还发现，添加低浓度糖蜜或葡萄糖碳源更有利于保持藻细胞活力，而且低浓度的糖蜜有显著促进藻细胞积累虾青素的作用。

本实验室也通过在f/2培养基中添加糖蜜或葡萄糖来培养三角褐指藻，结果显示添加糖蜜的培养基培养三角褐指藻，其生长量、岩藻黄素含量、总脂肪酸含量、EPA 含量均有所提高，并且同样是低浓度的糖蜜具有促进作用（待发表）。王绍杰等人在分批发酵试验基础上，进行了底物糖蜜流加补料发酵试验，结果显示，酵母菌的代谢产物麦角甾醇产量与生产效率均有显著提高[22-25]。

通过试验发现，在培养基中分别添加浓度为0.5 g/L的糖蜜或葡萄糖时，湖泊红球藻的生长量、合成虾青素含量都比BG11 培养基培养的湖泊红球藻的含量有显著提高。葡萄糖和糖蜜作为碳源相比，低浓度葡萄糖培养基对促进藻细胞生长的作用略优于糖蜜培养基，而低浓度糖蜜培养基比葡萄糖培养基能更显著地促进藻细胞在高光胁迫下合成虾青素。为使湖泊红球藻细胞密度达到最大，可在培养基中分别添加0.5 g/L的糖蜜和葡萄糖，同时在培养的第45 d 进行收获。为获得较高含量的虾青素，可在糖蜜浓度0.5 g/L 的培养基培养第25 d进行提取。

通过前人的研究发现，虾青素的合成受虾青素合成酶系基因psy和crtZ的调控，在施加醋酸钠、硫酸亚铁和强光照射等有效的虾青素诱导条件下，表达水平上升[26-29]。在GRUNEWALD 等[30]的试验中也观察到，虾青素合成酶基因pds和crtO的基因转录水平在胁迫诱导下均上调。本试验在高光照培养下，有可能诱导藻细胞虾青素合成酶系基因的表达水平，试验结果显示，同时添加低浓度糖蜜后，能显著促进湖泊红球藻细胞活性和藻细胞虾青素积累量。由此我们猜测，糖蜜中含有多种生物活性因子，与高光培养条件共同作用，有可能调控藻细胞虾青素合成酶系基因的活性，最终达到虾青素的大量积累。

虽然甘蔗糖蜜是蔗糖工业的废弃物，但它是海藻养殖的优质碳源。而且价格远低于葡萄糖。所以将生产废弃物糖蜜作为海藻培养基碳源添加物，既可降低生产成本，又可获得高附加值的天然生物活性物质，变废为宝，环保节能，是实现经济效益和社会效益兼顾双赢的利用方法。