放线菌V17 的分类鉴定及其对茶树炭疽病菌的拮抗作用

蔡甜星 ,刘楚非 ,蔡烈伟 ,陈美霞 ,郑世仲*

（1.宁德师范学院 生命科学学院，福建 宁德 352100；2.福建农林大学 园艺学院，福建 福州 350002 ）

茶树（Camellia sinensis L.）是山茶科山茶属的多年生常绿木本植物.茶叶炭疽病是引起茶树叶部发病的主要病害之一，茶叶炭疽菌（Gloeosporium theae-sinensis Miyake）病原菌又称茶盘长孢，属于半知菌亚门真菌，病害主要发生于成叶和老叶，叶缘和叶尖上的病斑较多[1].茶炭疽菌一般从茶树叶片伤口或嫩叶背面毛孔侵入，且在叶片正面散生许多细小的黑色子实体[2-4]，中后期使茶叶大量脱落，严重影响茶叶产量和质量[5-6].化学防治因存在污染且农药残留对人体有害，通过生物学方法对茶树病害进行防治逐渐受到广泛重视，研究表明，通过拮抗微生物制备生防菌剂防治茶树相关病害具有很大潜力[7].

放线菌（Actinomycetes）是最早被人类研究和广泛应用于农业生产的生防菌微生物[8].放线菌作为一种理想的生防菌，对许多植物病原菌具有较强的拮抗作用，且对寄主植物及其周围环境无害，在植物的生物防治等方面具有广阔的应用前景，已逐渐被广泛开发应用.目前人类发现的具有活性的次级代谢产物，尤其是抗生素、抗肿瘤免疫抑制剂及酶等，几乎一半以上都是由放线菌所产生[9].放线菌一般通过两种途径对靶标致病菌发挥生防作用：一是放线菌分泌一种乃至多种拮抗物质，影响病原菌的繁殖、生长，最后导致靶标致病菌死亡；二是通过竞争、抗生、捕食和重寄生作用，降低病原菌的致病性、侵染效率以及接种体密度，导致病原菌群体密度以及致病性下降[10].

目前，国内外关于茶树炭疽病的研究主要集中在炭疽病的病原学研究，对炭疽病病害微生物防治的研究还不够深入，且用于茶树炭疽病病害防治的有效拮抗微生物较少，在茶树炭疽病的防治应用中效果不理想，特别是关于拮抗微生物对茶树炭疽病的抗病机理的研究以及拮抗物质的分离还少有报道.本研究以课题组前期从宁德市蕉城区洋中镇茶园采集的土壤样品中分离的放线菌V17 作为研究对象，扩增其16S rDNA 序列，通过构建进化树确定其遗传分类地位，并探究其对茶树炭疽病拮抗机理，以期为今后V17 菌株开发为茶树炭疽病生防菌剂提供参考.

1 材料与方法

1.1 供试材料

胶孢炭疽菌（Colletotrichun gloeosporioides）由闽东特色生物资源福建省高校工程研究中心微生物研究室提供.

1.2 菌体总DNA 提取与16S rDNA 的PCR 扩增

将拮抗菌V17 接种活化，接种铲取高氏1 号培养基平板上的V17 到装有200 mL 高氏1 号液体培养基中进行摇瓶培养（28 ℃），3 d 后将菌液过滤，称取0.1 g 风干后的菌体，利用Bacteria Gen DNA kit全基因组提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）提取总DNA，微量核酸检测仪（Thermo Scientific）检测DNA 浓度和纯度.

以放线菌V17 基因组总DNA 为模板，细菌16S rDNA PCR 扩增通用引物27F/1429R（AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG/GGTTACCTTGTTACGACTT）为上下游引物扩增16S rDNA.反应体系为25 μL 体系，PCR 扩增程序：94 ℃5 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1.5 min，30 个循环，72 ℃1 min.取PCR 扩增后的产物，置于1%的琼脂糖凝胶，Universal DNA 回收试剂盒（天根生化科技有限公司）纯化回收目的片段送华大基因公司测序.

1.3 系统进化树分析

V17 菌株16S rDNA 测序结果进行NCBI-BLAST 同源性序列比对分析，并从中下载相似度最高的序列，将所选序列与拮抗菌V17 的16S rDNA 序列用MEGA6.0 软件（neighbor-joining，NJ 邻位相连法）构建分子系统遗传进化树.

1.4 V17 产真菌细胞壁水解酶能力测定

拮抗菌株V17 在高氏1 号平板活化，用打孔器将拮抗菌株V17 菌饼接到蛋白酶培养基平板、纤维素-刚果红培养基平板和葡聚糖培养基平板上,每个平板接3 个菌饼，28 ℃培养3 d，观察平板培养基变化.

1.5 放线菌V17 对茶树炭疽病菌丝生长的影响

用无菌打孔器分别将炭疽病病原菌胶孢炭疽菌的菌饼接种至PDA 培养基平板一侧，另一侧接种拮抗菌V17 菌饼，经培养6 d 后，挑取茶树炭疽病的菌落边缘的菌丝在显微镜下观察菌丝的形态有无变化，以没有接拮抗菌的胶孢炭疽菌菌丝作对照.

2 结果与分析

2.1 放线菌V17 的16S rDNA 序列扩增与菌种同源性分析

16S rDNA 序列PCR 扩增后，回收纯化后产物测序，扩增的V17 菌株16S rDNA 序列片段长度为1 402 bp(图1).对序列进行NCBI-BLAST 比对分析，挑选同源性较高的菌株16S rDNA 序列，用MEGA 6.0 软件构建遗传进化树（图2）.由图2 可知,V17 菌株和链霉菌属菌株（Streptomyces sp.strain AN090126）在进化树上聚在同一支，同时根据NCBI 数据库比对结果知，V17 菌株和Streptomyces sp.strain AN090126菌的16S rDNA 序列的同源性为99.86%，V17 菌株很可能为链霉菌属菌株.

图1 放线菌V17 16S rDNA 序列

图2 V17 菌株的系统进化树分析

2.2 V17 菌株产真菌细胞壁水解酶能力分析

将V17 菌株的菌饼分别接到蛋白酶培养基平板、纤维素-刚果红培养基平板和葡聚糖培养基平板上培养3 d 后，均可以在菌饼的四周围形成了水解圈（图3），这表明V17 菌株可以产蛋白酶、纤维素水解酶和葡聚糖酶.

图3 V17 菌株产真菌细胞壁水解酶分析

2.3 V17 菌株对茶树炭疽病菌丝生长的影响

V17 菌株与茶树炭疽病病原菌胶孢炭疽菌共培养6 d.分析平板菌落形态，V17 菌落和胶孢炭疽菌菌落之间可见明显抑菌条带，靠近V17 菌落的胶孢炭疽菌菌丝的生长受到抑制，生长缓慢，菌丝分布稀疏，边缘部分颜色变深形成灰褐色的斑块形状.挑取胶孢炭疽菌菌落边缘的菌丝在显微镜下观察菌丝的形态变化，结果见图4.胶孢炭疽菌菌丝受到V17 菌的影响发生一定程度的畸变，菌丝变粗、扭曲变形、菌丝交联严重、产生卵形的或是近圆形厚垣孢子等现象，而对照组正常生长的病原菌的边缘菌丝呈现出细直形态，菌丝之间没有交联（图4）.

图4 V17 菌株对胶孢炭疽菌菌丝生长的影响

3 讨论与结论

茶树炭疽病是茶园茶树的主要病害之一，尤其是南方山地茶园，一旦发病，容易造成茶树大量落叶，严重影响茶园经济效益.近年来，利用拮抗微生物防治植物病害，以其安全、环保和高效而受到越来越多人重视.拮抗菌来源较多，包括土壤或者植物内生细菌、放线菌和真菌.放线菌是天然抗生素的重要来源，主要存在于植物根际土壤中，对土壤改良具有重要作用，也是人们最早用于防治植物病害的生防菌，在农业生产中起了重要作用.目前，用于制备作物病害生防菌剂的放线菌主要为链霉菌属[11-12]，通过16S rDNA 扩增和遗传进化树分析，放线菌V17 也是链霉菌属.

放线菌主要通过分泌一些水解酶破坏寄主病原菌的细胞壁，进而达到拮抗病原微生物生长.Fatmawati 等[13]研究表明，放线菌对尖镰孢菌（Fusarium oxysporum.f.sp.cucmrium）生长具有抑制作用，同时可以水解淀粉、纤维素和脱脂乳等复杂化合物.本研究通过对V17 的产酶特性进行分析发现，V17菌株具有蛋白酶、纤维素酶和葡聚糖酶的能力，蛋白质、纤维素和葡聚糖是真菌细胞壁的主要成分，V17放线菌可以通过抑制真菌细胞壁的形成或者水解细胞壁进而影响真菌的生长.进一步分析放线菌V17对胶孢炭疽菌菌丝生长和孢子影响，发现胶孢炭疽菌菌丝和孢子均出现异常，这可能是放线菌V17 产生抗生素作用的结果.目前已发现的放线菌素有28 种，其中抑菌谱较广的有6 种[11,14].研究表明，放线菌能通过产生放线菌素类抗生素进而抑制病原菌的生长，比如多抗霉素使病原菌菌丝体顶端和孢子芽管出现肿大,进而使病菌难以侵染寄主植物，而我们研究发现的现象是，病原菌菌丝变粗扭曲变形、菌丝交联严重、产生卵形的或是近圆形厚垣孢子，与多抗霉素作用结果差别较大，这可能与V17 菌株代谢产物的理化性质有关，但是具体的组分、活性、稳定性以及物质结构有待进一步的深入研究.

综上，放线菌V17 为链霉菌属，具有开发为茶树炭疽病生防菌的潜在价值，研究结果为后期V17 开发为茶树炭疽病生防菌剂奠定了一定的理论基础.