黄连解毒汤对APP/PS1 小鼠海马记忆功能的影响

李洋，徐加志，张英华，胡灵佳，贾翠翠，孙磊

（齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

0 引言

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种与老龄化密切相关的神经退行性疾病[1]。纵观世界人口老龄化的发展趋势，AD 现已成为严重的老年人疾病，仅次于肿瘤和心血管疾病，所以，预防和治疗AD 的发生发展就成了目前关键的问题。β-淀粉样蛋白（Amyloid beta，Aβ）沉积形成老年斑（Senile plaque，SP）是AD 主要病理特征之一，SP形成后会使神经突触遭到破坏，丧失部分功能[2-3]。同时，有研究表示，AD 患者脑部突触发生损害，会严重导致记忆的缺失[4]。在AD 疾病中，IL-1β 表达的增高与Aβ 沉积密切相关[5]。目前国内外对于治疗AD 的方法有很多，但效果并不理想。祖国医药黄连解毒汤经过证实具有清热、解毒、抗炎等功效[6-8]，因此，本研究通过观察黄连解毒汤对APP/PS1 双转基因小鼠IL-1β 和TNF-α 表达的影响，探讨HLJDT对AD 疾病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

5 月龄APP/PS1 双转基因小鼠，雄性，16 只，同窝同背景野生小鼠，雄性，8 只作为对照，均购自南京生物医药研究院，生产编号为：SCXK（苏）2015-0001。由齐齐哈尔医学院动物实验中心饲养，本实验获得齐齐哈尔医学院伦理委员会批准。

1.1.2 药物制备及分组给药

黄连解毒汤由黄连（9g）、黄芩（6g）、黄柏（6g）和栀子（9g）4 味组成，均购买于黑龙江中医药大学附属第一医院。由医药科学研究院制成质量浓度为433g·kg-1的药液备用。并将5 月龄APP/PS1 双转基因小鼠分为模型组和HLJDT组（433g·kg-1），每组8只。对照组为野生小鼠。对照组和模型组小鼠均给予等体积的生理盐水（0.2mL·kg-1），连续灌胃35d。

1.1.3 仪器和试剂

Morris 水迷宫（上海移数信息技术公司，型号RD1101-MWM 型）；组织研磨器（北京天根，型号TGrinder）；小鼠IL-1β 和TNF-α 抗体（Abcam，货号ab234473 和ab183218）。

1.2 方法

1.2.1 morris 水迷宫检测

水迷宫是一个圆形水池，水池中心是透明厚板平台，上方连接追踪设备，池壁由红、黄、蓝、绿标记4 个象限。定位航行实验：连续5d 对小鼠进行训练，记录小鼠的潜伏期，即60s 内找到平台的时间；空间探索实验：摄像机追踪拍摄小鼠的运动轨迹，观察轨迹的变化情况。

1.2.2 新物体识别实验

实验在一个黑色封闭箱中进行。适应期：连续3d 将小鼠放入封闭箱中，每次10min。熟悉期：在箱里边缘对称的位置放2 个体积大小都相同的红色正方体木块，并将小鼠放于箱内5min。测试期：30min 后，绿色圆柱形积木替换箱内其中一个积木块，记录5min 小鼠对绿色圆柱形积木即新颖事物(T novel，TN) 和红色正方体即熟悉事物(T familiar，TF) 的探索行为，认知指数(recognition index，RI)=TN/ (TN+TF) ×100%。

1.2.3 RT-qPCR 检测

50mg 组织中 加500μl Trizol，研磨匀浆，提取总RNA，再将RNA 反转成cDNA，设计特异性引物：IL-1β 引物（F：5 ′ -GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3 ′；R：3 ′ -TGGATGCTCTCATCAGGACAG-5 ′），TNF-α 引物（F：5 ′ -CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3 ′）GAPDH 引物（F：5 ′ -GAGACCTTCAACACCCCAGC-3 ′；R：3′-CCACAGGATTCCATACCCAA-5′），加SYBR Green I 荧光染料，结果采用2-ΔΔCt法计算。

1.3 观察指标

1.3.1 潜伏期

潜伏期时间的长短代表着小鼠空间学习记忆能力的好坏，潜伏期短，预示着小鼠学习记忆能力好，反之，小鼠记忆能力减退。

1.3.2 运动轨迹

小鼠运动轨迹的不断变化能够清晰的看出学习记忆能力的改变。经过多次训练的小鼠会很快搜索到平台，表明学习记忆的提高；而记忆力差的小鼠则围绕池壁来回搜寻，却始终找不到平台。

1.3.3 认知指数

观察小鼠是否对新物品感兴趣，若否，则认为小鼠有记忆缺失的可能。

1.3.4 IL-1β、TNF-α mRNA 的表达

观察HLJDT 对IL-1β、TNF-α mRNA 表达的影响，判断是否可通过调节促炎因子的表达使小鼠记忆能力得到改善。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 水迷宫检测结果

2.1.1 对小鼠潜伏期的影响

与对照组进行比较，第1d 和第2d，模型组和HLJDT 组小鼠潜伏期无明显变化（P>0.05）；第3d、4d、5d，模型组潜伏期明显长于对照组（P<0.05）；与模型组比较，HLJDT 组小鼠潜伏期明显缩短（P<0.05），见图1。

图1 训练时三组小鼠的潜伏期

2.1.2 运行轨迹变化

对照组小鼠通过前5d 的训练，可以在短时间内找到平台；模型组小鼠只在池壁边缘搜寻，且不能找到平台；HLJDT 组虽围绕池壁搜寻，但最终可以找到平台，见图2。

图2 各组小鼠典型游泳轨迹

2.2 新物体识别实验

与对照组比较，模型组小鼠RI 降低（P<0.05）；与模型组比较，HLJDT 组小鼠RI 明显升高（P<0.05），见图3。

图3 各组小鼠的认知指数

2.3 RT-qPCR 检测结果

与对照组比较，模型组小鼠IL-1β、TNF-α mRNA 水平均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，HLJDT 组小鼠IL-1β、TNF-α mRNA 水平均明显降低（P<0.05），见图4。

图4 RT-qPCR 检测各组小鼠海马区IL-1β、TNF-α mRNA 水平的比较

3 讨论

AD 是一种随着年纪增加而在老年时期表现为“痴呆”的疾病。“痴呆”与年龄有着密切的关系。经研究发现，多数老年人会在50 岁以后发病，60 岁以上的老年人发病率最高[9-10]。AD 主要表现为记忆力减退，伴有严重的认知障碍[11]，随着病情的恶化，患者的生活能力会逐渐丧失，也会给家庭带来沉重的负担。

国内外研究学者对AD 疾病的预防和治疗已经研究逾百年，提出了β-淀粉样蛋白学说、胆碱能损伤学说等[12-13]，但都没有明确AD 的发病机制。临床上治疗AD 的药物也研发了多种，但药物的显著性尚不明了。炎症因子学说的提出，为AD 的治疗提出了新的研究方向，有研究显示，神经炎症的发生是由于脑组织中小胶质细胞的存在[14]，当AD 发生时，会有大量的Aβ 沉积，就会激活小胶质细胞释放大量的促炎因子IL-1β 和TNF-α，严重影响疾病的治疗[15-16]。

中医认为治疗AD 的主要环节应在“清热解毒、化痰消炎”。黄连解毒汤是清热解毒方的代表，在《肘后备急方》中首次记载了药物组成[17]。此方由黄连、黄芩、黄柏、栀子四味中药按3 ∶2 ∶2 ∶3的比例配伍而成，经研究表明，其具有抗炎、抗菌、抗氧化、清热解毒的功效，在临床应用中常被用于治疗AD、帕金森、癫痫等神经系统疾病。

本研究Morris 水迷宫结果表明，模型组潜伏期有所增加，长于对照组，而HLJDT 组潜伏期从第3天开始逐渐缩短，小鼠反应不再迟钝；通过观察小鼠运动轨迹我们发现，模型组小鼠的学习记忆能力较差，只围绕池壁来回搜寻，而HLJDT 组小鼠则能够找到平台，显著提高了学习记忆能力。新物体识别实验中，模型组小鼠认知指数降低，而HLJDT 组小鼠认知指数明显升高，说明HLJDT 能改善APP/PS1小鼠的学习和空间记忆能力，使“痴呆”样症状得到缓解。

综上所述，RT-qPCR 检测结果显示，HLJDT 可降低APP/PS1 小鼠海马区IL-1β 和TNF-α mRNA 的表达，对神经炎症的发展起到了保护作用。因此，本研究得出，HLJDT 可通过调节促炎因子的释放来发挥对AD 的保护作用，这也为AD 疾病的治疗提供新的研究思路。