胆道闭锁患儿肝组织中GPC3 和α-SMA 表达与肝功能指标的相关性分析

吴宙光,王 斌,程 珍,张文杰,左桃燕,陈思琦,付静茹

（深圳市儿童医院普外科，广东 深圳 518026）

胆道闭锁（biliary atresia，BA）是一种以进行性胆汁肝硬化为特征的新生儿胆管疾病，可导致胆汁淤积、肝纤维化和肝硬化，最终发展为晚期肝功能衰竭，病毒感染、毒素刺激和免疫失调参与BA的发生发展［1-2］。Kasai 手术治疗是其主要治疗方式，术后大部分BA 患儿易发生肝纤维导致肝硬化，需行肝移植治疗，因此早期寻找特异性生物标志物预测BA 术后疾病进展的敏感性血清学指标尤为重要。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（phosphatidylinositol proteoglycan 3，GPC3）在调节肝脏胚胎形态发生中发挥着重要作用，可作为肝纤维化进程的早期生物标志物和免疫治疗靶点［3-4］。α-平滑肌肌动蛋白（alphα-smooth muscle actin，α-SMA）是肝成纤维细胞的标志物，可促进肝纤维化进程，α-SMA 的高表达与肝纤维化程度呈正相关关系［5-7］。目前，关于BA 患儿GPC3 和α-SMA 的表达与肝功能指标及预后相关性的研究较少。因此，本研究探讨BA患儿肝组织中GPC3 和α-SMA 的表达与肝功能指标的相关性，以期为指导BA 患儿术后精准治疗及预后判断提供重要的依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象、主要仪器和试剂选择广东省深圳市儿童医院普外科2018 年6 月—2019 年12 月就诊的BA 患儿26 例，所有患儿均行Kasai 术。选择同期20 例接受肝活检且无纤维化的胆总管囊肿患儿为对照组。术后随访6 个月（门诊或住院随访复查）后根据肝功能水平分为预后良好组18 例和预后不良组8 例。纳入标准：符合BA 诊断的患儿，资料完整者及配合检查者，其中BA 患儿肝脏病理活检符合肝小叶间胆管缺如（胆管数/汇管区≤2 mm），肝内胆管显影不清晰，造影剂渗漏。排除标准：资料不完整、不配合检查、失访者、胆道发育不良、胆汁淤积症和肝脏肿瘤患儿。所有患儿家属均知情同意并签署同意书，此项研究通过本院伦理委员会批准。CFX96 荧光定量PCR 仪为美国Bio-Rad 公司产品，GPC3 和α-SMA 蛋白一抗购自美国Merck Millipore 公司。PCR 试剂（2×RealStar Green Power Mixture）购自Genstar 公司。GPC3引物序列为5'-GATACAGCCAAAAGGCAG-3'和5'-ATCATTCCATCACCAGAG-3'，α-SMA引物序列为5'-CTGCTGAGCGTGAGATTGTC-3'和5'-CTCAAGGGAGGATGAGGATG-3'。

1.2 观察指标和分组收集所有研究对象的社会人口学特征和临床数据，包括手术时年龄、性别，血清白蛋白（albumin，ALB）、总胆红素（total bilirubin，TB）、直接胆红素（direct bilirubin，DB）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和γ-谷氨酰转氨酶（γ-gamma glutamyl transferase，γ-GGT）水平；根据血清TB和ALT 水平及临床表现，将患儿分为预后良好组和预后不良组。预后良好组：手术成功后6 个月，大便颜色由淡变为淡黄色，血清TB 水平恢复正常，肝功能满意（TB＜34.2 μmol·L－1，ALT＜100 IU·L－1）；预后不良：Kasai术后6个月出现胆汁淤积，严重肝功能障碍（TB ≥34.2 μmol·L－1，ALT≥100 IU·L－1）。肝纤维化程度采用Metavir 评分，根据肝纤维化程度分为F0～F4组，F0-1组（0～1分）、F2-3 组（2～3分）和F4组（4分），Metavir评分≥2分为显著肝纤维化，Metavir 评分4 分为肝硬化。

1.3 实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）和免疫组织化学法检测肝组织中GPC3 和α-SMA mRNA 和蛋白表达水平采用TRIzol 法提取肝组织RNA，逆转录为cDNA，行RT-qPCR 法检测，GAPDH 为内参管家基因，采用2－ΔΔCt法计算肝组织中GPC3 和α-SMA mRNA 表达水平，每个样本重复3 次。采用免疫组织化学法分析肝组织中GPC3 和α-SMA 蛋白表达，肝组织标本石蜡包埋，组织切片脱蜡后，0.3%过氧化氢抑制内源性过氧化物酶活性10 min，予以10 mmol·L－1柠檬酸缓冲液（pH6.0）抗原恢 复5 min，孵育一抗2 h，随后用辣根过氧化物酶结合的二抗在室温下孵育45 min，反应产物用3，3-四盐酸盐二氨基联苯胺染色，并用苏木精对切片进行复染。细胞核或胞质染成棕色或棕黄色判定为GPC3 和α-SMA 蛋白表达阳性。GPC3 和α-SMA蛋白半定量分析根据阳性细胞百分率评分。0 分：阳性细胞＜1%；1 分：阳性细胞1%～25%；2 分：阳性细胞26%～50%；3 分：阳性细胞51%～74%；4 分：阳性细胞≥75%。GPC3 和α-SMA 的染色强度评分：（－）未染色，（+）弱染色，（⧺）中度染色，（⧻）强染色。阳性区域检测GPC3 和α-SMA 阳性细胞随机选择的5 个视野（×200）。

1.4 统计学分析采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。2 组患儿年龄、ALB、TB、TB、DB、ALB、ALT、AST、ALP 和γ-GGT 水平均符合正态分布，以表示，2 组间样本均数比较采用两独立样本t检验；Metavir 评分及肝组织中GPC3 和α-SMA mRNA 及蛋白表达水平不符合正态分布，以中位数（四分位数）表示，组间比较采用非参数分析（Mann-WhitneyU检验）；计数资料（性别）以例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson 相关分析评估GPC3 和α-SMA 表达水平与肝功能指标（ALB、TB、DB、ALT、AST、ALP、γ-GGT 和Metavir 评分）的相关性。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般基线资料与对照组比较，BA 组患儿手术年龄更低（P＜0.01），血清中TB、AST、ALP和γ-GGT 水平及Metavir 评分明显升高（P＜0.05）；2 组患儿性别构成比、ALB 和ALT 水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 2 组患儿一般临床资料Tab.1 General clinical data of children in two groups

2.2 2 组患儿肝组织中GPC3 和α-SMA mRNA 表达水平及其相关性与对照组比较，BA 组患儿肝组织中GPC3 和α-SMA mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）；BA 组患儿肝组织中GPC3 与α-SMA mRNA 表达水平呈正相关关系（r=0.537，P=0.005）。见表2。

表2 2 组患儿肝组织中GPC3 和α-SMA mRNA 表达水平Tab.2 Expression levels of GPC3 and α-SMA mRNA in liver tissue of patients in two groups [M(P25,P75)]

2.3 2 组患儿肝组织中GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平免疫组织化学法检测肝组织中GPC3 蛋白表达情况，26 例先天性BA 患儿肝组织标本中，21 例（80.8%）BA 患儿肝组织GPC3 蛋白表达阳性，胆道上皮细胞和肝实质细胞的细胞质中均可检测到GPC3 蛋白的过表达（图1A）；与BA 组比较，对照组患儿肝组织中GPC3 蛋白表达不明显，胞浆染色微弱。根据α-SMA 定位，20 例（76.9%）BA 患儿肝脏中α-SMA 蛋白染色阳性，BA 组患儿肝脏中，α-SMA 蛋白主要表达于门静脉束周围的成纤维细胞的细胞质中，主要是胆管和胆管间隙（图1B），而对照组患儿非BA 肝组织α-SMA 蛋白染色阴性。

图1 2 组患儿肝组织中GPC3（A)和α-SMA（B）蛋白表达情况（免疫组织化学，×200）Fig.1 Expressions of GPC3(A) and α-SMA(B) proteins in liver tissue of patients in two groups(Immunohistochemistry，×200）

与对照组比较，BA 组患儿肝组织中GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平升高（P＜0.01）。见图2。

图2 2 组患儿肝组织中GPC3（A）和α-SMA（B）蛋白表达半定量分析Fig.2 Semi-quantitative analysis of GPC3(A) and α-SMA(B) protein expressions in liver tissue of patients in two groups

2.4 BA 组患儿肝组织中GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平与肝功能指标的相关性Pearson 相关分析结果显示：GPC3 蛋白表达水平与患儿年龄（r=－0.384，P=0.026）、ALB水平（r=－0.514，P=0.005）和AST 水平（r=－0.327，P=0.035）呈负相关关系，与ALP 水平（r=0.582，P=0.008）和Metavir 评分（r=0.468，P=0.016）呈正相关关系；α-SMA 蛋白表达水平与ALP 水平（r=0.465，P=0.016）和Metavir评分（r=0.422，P=0.010）呈正相关关系。见表3。

表3 BA 组患儿肝组织中GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平与肝功能指标的相关性分析Tab.3 Analysis on correlations of GPC3 and α-SMA protein expression levels in liver tissue with liver function indexes of patients in two groups

2.5 不同预后组患儿肝组织中GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平及肝纤维化程度与预后良好组比较，预后不良组患儿肝组织中GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平及Metavir 评分升高（P＜0.01）。见表4。

表4 不同预后组患儿肝组织中GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平及Metavir 评分Tab.4 Expression levels of GPC3 and α-SMA proteins in liver tissue of and Metavir scores of patients in different prognostic groups [M(P25,P75）]

3 讨论

BA 发病机制不明确，主要与遗传、病毒感染和免疫调节等多因素有关，通常采用Kasai 肝门空肠吻合术（KPE）进行手术治疗。然而，大部分BA 患者仍因肝纤维化进展为肝硬化需进行肝脏移植治疗［8-9］。因此，研究者迫切需要更好地了解BA患儿KPE 术后疾病进展及其与肝功能障碍及纤维化的相关分子标志物，可能有助于改善患儿的临床结局和推迟肝移植治疗的时间［2，8］。目前BA 肝纤维化发病机制的分子机制尚未完全阐明，参与Wnt/β-catenin 和（或）hedgehog 信号通路的GPC3可作为预测肝癌疾病进展的生物标志物，对肝癌患者的疾病进展及预后具有重要预测价值［4，10］。α-SMA 蛋白表达水平升高促进肝纤维化和肝损伤程度，可作为预测肝硬化甚至肝癌进展的有效指标［7，11］。目前很少有研究探讨GPC3 和α-SMA 蛋白与BA 患儿疾病进展的关联性。因此，本研究通过分析胆道闭锁患儿GPC3 和α-SMA 蛋白的表达与肝功能指标的相关性，为今后BA 治疗提供重要方向。

GPC3 是硫酸肝素蛋白聚糖家族的一员，通过糖基磷脂酰肌醇键附着在质膜的外表面，通过结合多种信号通路调控细胞增殖生长、黏附和形态发生，如Hedgehog 信号通路、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和Wnt 信号通 路［4，12］。GPC-3在肝细胞癌（hepalic cell carcinoma，HCC）中过表达，通过激活Wnt/β-catenin 信号通路，促进肝细胞形态学发生改变，促进肝癌的增殖生长，目前已成为诊断HCC 的敏感性和特异性较高的生物标志物［13-15］。另有研究［12，14，16］显示：Wnt/β-catenin 信号通路是BA 胆道形态发生的主要调控机制之一，提示GPC-3 与Wnt/β-catenin 信号相互作用失调在胆管发育中发挥着关键作用。因此，GPC3 可以作为预测胆管发育性疾病的生物标志物。本研究结果表明：与对照组比较，BA 组患儿肝组织中GPC3mRNA 和蛋白表达水平明显上调，考虑可能是BA患儿存在肝功能障碍和肝纤维化改变，引起GPC3蛋白的高水平表达。

研究［4，11，17］表明：α-SMA 可通过多种机制（刺激生长因子的产生和细胞外基质的重塑）促进多种细胞的生长和增殖，包括肝癌细胞，提示α-SMA 对BA 细胞形态发育的调控具有重要作用，另外，α-SMA 在预测肝纤维化进程中可作为敏感的生物标志物，α-SMA 的高表达多提示肝癌患者的预后不良，研究［5，18-19］显示：肝α-SMA 蛋白表达水平升高可作为BA 患儿梗阻性胆管病变的生物标志物，与肝纤维化分期级别呈正相关关系。细胞质α-SMA 的表达是肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）激活的组织病理学标志物，HSCs 可活化成肌成纤维细胞，α-SMA 的表达可促进大量分泌细胞外基质，促进肝纤维化进程［7，19-20］。在本研究中，与对照组比较，BA 组患儿肝组织中α-SMA mRNA 和蛋白表达明显上调，提示α-SMA参与了BA 的发生发展。今后需对BA 患儿术后α-SMA 生物标志物进行检测，为判断预后提供依据，并对肝纤维化病变予以相应干预措施，可延缓疾病进展，缩短肝移植治疗时间。

GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平与肝功能指标的相关性研究结果显示：GPC3 蛋白表达水平与患儿年龄，血清中ALB 和AST 水平呈负相关关系，与ALP 水平和Metavir 评分呈正相关关系，表明GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平的升高与肝损伤和肝纤维化进展相关。本研究BA 患儿预后分析结果显示：预后不良组患儿肝组织中GPC-3 和α-SMA蛋白表达水平较预后良好组明显升高，且肝纤维化Metavir 评分明显升高，提示BA 术后GPC3 和α-SMA 蛋白明显升高与预后不良相关，证实GPC3和α-SMA 可作为BA 术后早期预测肝纤维化发生的生物标志物。另外，本研究仅检测了BA 患儿、对照组及不同预后组BA 患儿GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平，探讨了其与肝功能指标的相关性，尚存在不足；今后拟进一步扩大样本量检测相关信号通路变化，即Wnt/β -catenin 信号分子（CTNNB、c-Myc 和CCND-1），探讨GCP3 的具体分子作用机制；另外，本研究仅检测了BA 患儿术后6 个月的GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平，今后拟分析不同GPC3 和α-SMA 蛋白表达水平组BA 患儿远期预后情况。

综上所述，BA 组患儿肝组织中GPC3 和α-SMA mRNA 及蛋白表达水平明显升高；BA 组患儿肝组织中GPC3 与α-SMA mRNA 表达水平呈正相关关系，且预后不良组BA 患儿肝组织中GPC3和α-SMA蛋白表达水平升高，而GPC3和α-SMA的高表达与肝功能障碍相关指标（ALP 水平和Metavir 评分）呈正相关关系。本研究结果提示：GPC-3 和α-SMA 可能成为反映BA 患儿肝功能障碍严重程度和肝纤维化程度的潜在标志物，为研究BA 的非移植治疗策略提供重要的靶向免疫治疗方向，以延缓BA 患儿疾病进展。