三焦针法对SAM 小鼠血脑屏障通透性的改善作用及通过RhoA/ROCK 通路的调控作用

王 煜 ,阚伯红 ,赵 岚 ,史慧妍 ,贾玉洁

(1.天津中医药大学第一附属医院针灸科，天津 300193;2.国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300193；3.天津中医药大学第一附属医院针灸研究所，天津 300193)

阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）属神经系统退行性疾病，AD 和帕金森综合征等退行性疾病中均发现血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）透过率增强，而BBB 可影响物质进出大脑［1］。BBB 完整性对于维持大脑平衡具有重要作用，BBB 透过率增强导致生物入侵，病毒、细菌和酵母菌等微生物群透过BBB 进入血液，感染脑部或伴有癫痫发作，影响健康［2］。电针可以减轻阿尔茨海默病患者智力障碍并提高学习记忆功能［3］，三焦针法是根据AD 本虚标实的病理机制，通过调理三焦达到充养先天和治疗AD 的目的［4］，但三焦针法是否影响BBB 尚不清楚。BBB 功能需要多种转运蛋白参与，BBB 结构发生变化会导致微血管生成异常，并伴随影响BBB 功能蛋白变化，RhoA/Rho 相关蛋白激酶（Rho associated protein kinase，ROCK）通路在脑缺血/再灌注损伤大鼠中可被激活，导致血管通透性增加，导致水肿和破坏BBB，抑制RhoA/ROCK 通路保持BBB 的完整性［5］。本研究以SAMP8 老年痴呆小鼠为SAM 小鼠模型，探讨三焦针法对SAM 小鼠BBB 通透性的影响，其机制可能与抑制RhoA/ROCK 通路有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品、试剂和仪器SAMP8 小鼠36 只，SAMR1 正常衰老小鼠12 只，雌雄各半，7 月龄，体质量（25±2）g，由天津中医药大学第一附属医院快速老化鼠繁育中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（津）2015-0003。所有小鼠于本院动物房饲养，饲养条件：温度25 ℃，湿度50%，噪音＜80 分贝，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气，自然光照，自由饮食和饮水。本实验经本院伦理委员会批准，实验动物符合3R 原则。伊文思蓝溶液购自德国CNW 公司，货号：CFEQ-4-450207-000；一抗闭合蛋白（occludin protein，Occludin）、密封蛋白 5（claudin protein-5，Claudin-5）、闭锁连接蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）、RhoA、ROCK 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）均购自英国Abcam 公司，货号分别为ab167161、ab131259、ab61357、ab187026、ab45171 和ab8245。Libra200 型透射电镜购自德国Zeiss 公司；SA208 型Morris 水迷宫系统购自江苏赛昂斯生物科技有限公司。

1.2 实验动物分组将36 只SAMP8 小鼠随机分为模型组、非穴位组和穴位组，每组12 只；对照组为12 只SAMR1 小鼠。各组小鼠参考《实验针灸学》［6］小鼠图谱，由本院针灸经验丰富的医师对所有小鼠进行针灸，非穴组在与腹中线平行、过髂嵴尖端直上2 mm 处，1.5 寸毫针向下斜刺约3 mm，角度90°～180°、频率60～120 min－1，每侧各105 s；穴位组：三焦针法针刺血海穴（双）直刺2～3 mm，大幅度（角度＞180°）、低频率（频率＜60 min－1）捻转泻法30 s，膻中、中脘、气海和足三里（双）直刺2～3 mm，小幅度（角度＜90°）、高频率（频率＞120 min－1）捻转泻法30 s；每日1 次，连续6 d、第7 天休息，连续干预4 周；对照组为SAMR1 正常衰老小鼠12 只，对照组和模型组小鼠正常饲养，不进行处理。

1.3 Morris 水迷宫实验检测小鼠学习和记忆功能按参考文献［7］对小鼠进行适应训练，操作方法：黑色内壁不锈钢水池（直径150 cm、深40 cm），水池上方与计算机摄像头相连，水池平均分成4 个象限，第一象限中央放黑色圆形逃生平台（直径14 cm，高29 cm），水池中注入超过平台1～2 cm 的水，水温（23±2）℃。第1 天所有小鼠在水中适应1 min，观察小鼠游泳速度和泳姿，剔除在水中不动或打转、出现明显划水障碍的小鼠，更换合格小鼠。第2～7 天进行Morris 水迷宫适应训练。定位航行实验：小鼠面朝池壁随机从4 个象限之一放入水中，记录小鼠找到逃生平台时间（逃避潜伏期）；若60 s 内未找到，则引导其找到平台，停留20 s，每天训练4 次，连续训练观察6 d。空间探索实验：定位航行实验结束后24 h 撤去水下平台，除第1 象限外随机选取一个象限，将小鼠面朝池壁投入池中，记录其自由游泳60 s 在原平台所在区域的停留时间（空间探索时间）。

1.4 伊文思蓝染色法检测各组小鼠脑组织中伊文思蓝含量Morris 水迷宫实验结束后，每组随机选取6 只小鼠进行伊文思蓝实验。小鼠处死前2 h 进行腹腔麻醉，尾静脉注射2% 4 mL·kg－1伊文思蓝溶液，小鼠皮肤和四肢变蓝表明注入成功。断头取脑并称质量，加入5 mL 甲酰胺溶液，54 ℃恒温孵育24 h，14 000 r·min－1离心20 min，取上清，酶标仪在630 nm 处检测吸光度（A）值，计算小鼠脑组织中伊文思蓝含量。

1.5 透射电镜下观察小鼠BBB 超微结构每组剩余6 只小鼠腹腔麻醉后立即处死，左侧海马组织置于2.5%戊二醛和1%锇酸固定，右侧海马组织置于－80 ℃冰箱保存。固定后的海马组织，经丙酮逐级脱水，包埋剂包埋后制成超薄切片（厚度为50 nm），醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察BBB 超微结构。

1.6 蛋白免疫印迹检测小鼠海马组织中Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA 和ROCK 蛋白表达水平－80 ℃冰箱取出部分海马组织，添加蛋白裂解液冰上研磨后提取海马组织总蛋白，凝胶电泳分离蛋白、PVDF 膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，清 洗PVDF 膜，加入对应一抗Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA、ROCK 和GAPDH，置于4 ℃孵育过夜；加入对应二抗，室温孵育1 h。蛋白凝胶成像系统拍照和定量分析。以β-actin 作为内参照，计算各蛋白条带灰度值与β-actin 蛋白条带灰度值的百分比，作为蛋白表达水平。

1.7 统计学分析采用GraphPad Prism8.0 统计软件进行统计学分析。各组小鼠逃避潜伏期和空间探索时间，脑组织中伊文思蓝含量，海马组织中Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA 和ROCK 蛋 白表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠学习和记忆功能与对照组比较，模型组和非穴位组小鼠逃避潜伏期增加（P＜0.05），空间探索时间减少（P＜0.05），穴位组小鼠逃避潜伏期增加（P＜0.05）；与模型组和非穴位组比较，穴位组小鼠逃避潜伏期减少（P＜0.05），空间探索时间增加（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠逃避潜伏期和空间探索时间Tab.1 Escape latencies and space exploration times of mice in various groups (n=12，,t/s)

表1 各组小鼠逃避潜伏期和空间探索时间Tab.1 Escape latencies and space exploration times of mice in various groups (n=12，,t/s)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with non-acupoint group.

2.2 各组小鼠脑组织中伊文思蓝含量对照组、模型组、非穴位组和穴位组脑组织中伊文思蓝含量分别为（3.10±0.42）μg·g－1、（8.96±1.11）μg·g－1、（9.08±0.86）μg·g－1和（4.79±0.43）μg·g－1。与对照组比较，模型组、非穴位组和穴位组小鼠脑组织中伊文思蓝含量均明显升高（P＜0.05）；与模型组和非穴位组比较，穴位组小鼠脑组织中伊文思蓝含量明显减少（P＜0.05）。

2.3 各组小鼠BBB 超微结构对照组小鼠血管内皮细胞胞膜完整且清晰，核仁形态规则，基底膜厚度均匀，未见血管周围水肿情况；模型组和非穴位组小鼠血管内皮细胞边界模糊，基底膜增厚，部分出现断裂现象，血管水肿明显；穴位组小鼠血管周围水肿现象明显缓解，内皮细胞基本处于正常状态，BBB 情况得以改善。见图1。

2.4 各组小鼠海马组织中Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA 和ROCK 蛋白表达水平与对照组比较，模型组和非穴位组小鼠海马组织中Occludin、Claudin-5 和ZO-1 蛋白表达水平降低（P＜0.05），RhoA 和ROCK 蛋白表达水平升高（P＜0.05），穴位组小鼠海马组织中Claudin-5 和ZO-1 蛋白表达水平降低（P＜0.05），RhoA 和ROCK 蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与模型组和非穴位组比较，穴位组小鼠海马组织中Occludin、Claudin-5 和ZO-1蛋白表达水平升高（P＜0.05），RhoA 和ROCK 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图2 和表2。

表2 各组小鼠海马组织中Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA 和ROCK 蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of Occludin,Claudin-5,ZO-1,RhoA and ROCK proteins in hippocampal tissues of mice in various groups (n=6，）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with non-acupoint group.

图2 各组小鼠海马组织中Occludin、Claudin-5、ZO-1、RhoA 和ROCK 蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of Occludin,Claudin-5,ZO-1,RhoA,and ROCK proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

3 讨论

AD 发病过程中伴有BBB 通透性增加和血管内皮细胞结构异常现象，BBB 通透性增加或促进老年斑的加速形成［8］，造成BBB 受损；血管受损后导致转入脑组织中β-淀粉样蛋白增多，转出脑组织的主要载体表达量减少，促进β-淀粉样蛋白在脑内聚集和沉积，进一步加重BBB［9］，β-淀粉样蛋白的聚积与BBB 的损伤互为因果，影响AD 的发展；进一步增加有害物质进入脑中，营养物质及代谢产物紊乱，脑组织环境破坏，损伤神经元［10］。本研究结果显示：模型组小鼠逃避潜伏期和脑组织中伊文思蓝含量升高，空间探索时间减少，血管内皮细胞边界模糊，基底膜增厚，部分出现断裂现象，血管水肿明显，小鼠学习和记忆功能减退，出现脑组织损伤，提示BBB 通透性增加，脑组织损伤严重，导致小鼠学习和记忆功能减弱。

中医AD 属“痴呆”“善忘”范畴，肾主骨生髓，心、脑和肾等功能失调，导致气血不足、肾经失充、脑络不通和脑髓失养，形成AD［11］。《难经·六十六难》曰：“三焦者，原气之别使也，主通行三气，经历五脏六腑”，基本法则是梳利三焦，重在“通、化、调”，是机体体液运行之通道，执行了腐熟水谷、宣痛气血津及通调水道作用，诸穴合用，使得三焦气机条畅，同时益气调血培补肾精元气、抚助人根本［12］。本研究结果显示：与模型组比较，穴位组小鼠逃避潜伏期和伊文思蓝含量降低，空间探索时间增加，提示经三焦针法针刺AD小鼠后，小鼠学习和记忆功能均有所提升，血管肿胀现象有所缓和，BBB 通透性降低。

BBB 通透性增加与多种转运蛋白的变化有关，RhoA 主要存在于神经细胞内，是重要的调节激动蛋白细胞骨架和细胞形态的中介因子，RhoA 高表达可促进内皮细胞中丝状肌动蛋白F-actin 聚集成束，形成应力纤维［13］；RhoA 作为重要生物信号分子，下游ROCK 是目前功能最为清楚的下游靶效应分子，可介导紧密连接蛋白的重新分布，ROCK活化通过增加平滑肌中肌球蛋白轻链磷酸化水平和钙离子敏感性，诱导内皮屏障功能障碍，增加BBB 通透性［14-15］。BBB 的完整性受多种内环境稳态的控制，包括毛细血管内皮细胞、紧密连接、星形胶质细胞足底、周细胞、基底膜和细胞外基质［16］。Occludin 是第1 个被确定的紧密连接蛋白跨膜蛋白，影响屏障特征、细胞迁移和增殖、细胞生长和分化、改变细胞通透性［17］；ZO-1 是紧密连接蛋白主要结构蛋白，其表达量和分布情况与BBB的完整性相关［18］，Occludin 与ZO-1 相互作用调节BBB 和血管的通透性及蛋白的表达量［19］；Claudin-5 是紧密连接蛋白关键整合膜蛋白，调节BBB 的完整性和通透性［20］。本研究结果显示：与对照组比较，模型组小鼠海马组织中Occludin、Claudin-5 和ZO-1 蛋白表达水平降低，RhoA 和ROCK 蛋白表达水平升高，提示AD 小鼠海马组织中RhoA/ROCK 通路处于激活状态，可增加BBB通透性，表现在影响BBB 的紧密连接蛋白水平降低上；与模型组比较，穴位组小鼠海马组织中Occludin、Claudin-5 和ZO-1 蛋白表达水平升高，RhoA 和ROCK 蛋白表达水平降低，提示SAM 小鼠经三焦针法针刺后，RhoA/ROCK 通路激活状态被抑制，紧密连接蛋白水平升高，ZO-1 充当细胞内支架蛋白，将Occludin 和Claudin-5 锚定在细胞骨架上调节紧密连接蛋白完整性，从而改善BBB通透性。

综上所述，三焦针法可改善SAM 小鼠所致的BBB 通透性增加现象，可能是通过抑制RhoA/ROCK 通路增加紧密连接蛋白实现的，且本研究首次验证三针焦法改善BBB 通透性。但影响BBB 通透性机制复杂，三针焦法亦可能通过其他通路发挥作用，发现新的通路也是本课题组下一步研究的重点。