CsgRNA减少APOBECs在Cas9-D10A介导的基因编辑过程中引入的突变

任蓉蓉，陈红全

1.浙江医院 医学检验科，浙江 杭州 310013；2.浙江大学医学院附属邵逸夫医院 检验科，浙江 杭州 310016

CRISPR/Cas9系统是强大的基因编辑工具，近几年得到广泛的应用[1-4]。近期，研究者将APOBECs（members of the apolipoprotein B mRNA-editing enzyme,catalytic polypeptide-like）蛋白和CRISPR系统紧密的联系在了一起[5-7]。我们的前期研究发现应用Cas9-D10A/sgRNA进行基因编辑时，APOBEC-3B蛋白能够引入非目的突变[5]，因此有必要优化Cas9-D10A/sgRNA系统的保真性。应用Cas9-D10A/sgRNA进行基因编辑时，D10A能够切割双链DNA的单链后形成切口样结构，从而暴露出DNA单链，而APOBECs蛋白具有胞苷脱氨酶活性，能够攻击单链DNA的胞嘧啶脱氨使其变为尿嘧啶，使单链DNA发生碱基突变。本研究根据上述现象提出以下理论设想：对Cas9-D10A/sgRNA系统设计csgRNA（chaperone sgRNA），使D10A进行基因编辑时产生的DNA单链结构能够与csgRNA形成碱基互补配对，从而形成双链样结构，降低APOBECs的攻击，以减少APOBECs对Cas9-D10A进行的基因操作形成的单链DNA引入突变，从而降低突变率。

1 材料和方法

1.1 质粒构建与引物设计 Cas9（pST1374-N-NLSFlag-linker-Cas9）、D10A（pST1374-N-NLS-flaglinker-D10A）、H840A（pST1374-N-NLS-flag-linker-H840A）和dCas9（pST1374-N-NLS-flag-linker-dead Cas9）等表达载体由上海科技大学黄行许教授馈赠，sgRNA表达载体由pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro（Addgene 51133）构建完成；sgRNA4和FANCF打靶位点的sgRNAs序列和其各自的上下游PCR引物序列见表1。

表1 sgRNAs序列和引物序列

1.2 细胞培养和转染 293FT、293FT-A3B和293FTA3Bm细胞系由上海科技大学陈佳教授馈赠，所有细胞均在DMEM（10566，美国Gibco公司）+10% FBS（16000-044，美国Gibco公司）、37 ℃条件下培养；细胞以2×105/孔，接种于12 孔细胞培养板，8 h后用LipofectamineTM2000（美国Thermo Fisher Scientific 公司）转染，转染试剂包括125 μL Opti-MEM+2 μg Cas9表达载体+1 μg sgRNA表达载体+3 μL Lipofectamine，24 h后加终质量浓度为 1 μg/mL的嘌呤霉素（ant-pr-1，美国InvivoGen公司）药筛，48 h后用酚氯仿法抽提基因组DNA。

1.3 T7EN1酶切实验 首先用PCR方法扩增sgRNA打靶位点上下游DNA序列，PCR反应程序如下：94 ℃，5 min；（98 ℃，10 s，72～62 ℃，每循环降低1 ℃，15 s；72 ℃，30 s）10个循环，（98 ℃，10 s；62 ℃，15 s；72 ℃，30 s）25个循环；72 ℃，5 min；4 ℃ 保持，PCR产物用PCR清洁试剂盒（美国Axygen公司，AP-PCR-50）纯化，纯化后的PCR产物进行退火（体系为：NEB Buffer2，2 μL，PCR产物，200 μg，纯水补齐至20 μL。退火程序：95 ℃ 5 min；95～85 ℃，每秒降低2 ℃；85～25 ℃，每秒降0.1 ℃；4 ℃保持）。退火产物放于冰上，每个体系加入0.3 μL T7核酸内切酶I，37 ℃孵育25 min，之后用2.5%琼脂糖凝胶电泳（100 V，25 min）。

1.4 统计学处理方法 采用GraphPad Prism5统计学软件进行分析，2组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 APOBEC-3B显著增强Cas9-nickase基因编辑的突变率 有研究表明APOBEC-3B过表达可显著增强Cas9-nickase基因编辑的突变率[5]。本研究首先在293FT-A3B过表达细胞系上检测Cas9-nickase的基因编辑效率。选取sgRNA4和sgFANCF打靶位点，构建载体，脂质体法转染293FT、293FT-A3B和293FTA3Bm细胞系，通过T7EN1酶切实验检测其编辑效率，结果如图1所示，Cas9在三种细胞系上对四个位点均产生了非常明显的切割条带，在293FT-A3B过表达细胞系中，Cas9-D10A对两个位点均产生了明显的切割，Cas9-H840A的切割条带较弱，而在293FT和293FT-A3Bm细胞系则检测不到肉眼可见的切割条带，这表明APOBEC-3B过表达显著增强了Cas9-D10A进行基因编辑时产生的突变。

图1 T7EN1酶切凝胶图显示APOBEC-3B过表达显著增加了Cas9-nickase/sgRNA的突变率

2.2 csgRNA降低由APOBEC-3B引起的Cas9-nickase基因编辑突变率 为降低APOBEC-3B对Cas9-D10A进行基因编辑时引入的突变，我们拟通过csgRNA策略予以解决，其原理示意图见图2A。根据以上理论原理，本研究在sgRNA4和sgFANCF位点上设计csgRNA，其长度为20 bp，构建双U6（sgRNA+csgRNA）载体、转染293FT-A3B细胞系，T7EN1酶切实验检测结果见图2B，结果显示在A3B过表达细胞系中，csgRNA降低了D10A在sgRNA4和sgFANCF打靶位点所产生的切割条带，这表明csgRNA策略能够降低D10A进行基因编辑时APOBEC3B蛋白对单链DNA的攻击，从而减少突变的发生。

图2 CsgRNA策略对Cas9-D10A基因编辑效率分析

2.3 csgRNA条件的优化 对csgRNA的长短、作用位置进行优化。选取sgRNA4打靶位点，设计了24个csgRNA，其长度和作用位置见图3A，构建双U6载体，脂质体法转染293FT-A3B细胞系，T7EN1酶切实验检测基因编辑效率，结果见图3B。1、2、8、9、10、13号csgRNA其D10A切割条带显著降低了，其csgRNA对Cas9的切割条带无影响。对Cas9和D10A产生的切割条带进行灰度扫描，D10A/Cas9切割条带灰度值比值见图3C，其中1、11、15、21号csgRNA和S4比差异无统计学意义（P＞0.05），其他csgRNA差异均具有统计学意义（P＜0.05）。8号（csgRNA长度为16 bp、向PAM端延伸2个碱基）和9号（csgRNA长度为20 bp、向PAM端延伸4个碱基）csgRNA既能确保Cas9/sgRNA4的基因编辑效率，对降低D10A/sgRNA4进行基因编辑时APOBEC-3B蛋白引入的突变其效果相对更好一些。

图3 csgRNA长度和位置的优化

2.4 8 号csgRNA在Cas9 nickase上的作用效果 选取8号csgRNA，以sgRNA4和sgFANCF为打靶位点，在293FT-A3B细胞系上进一步验证8号csgRNA的保护性效果，并看其在Cas9-D10A和Cas9-H840A上的作用效果。转染293FT-A3B细胞系，T7EN1酶切结果和D10A/Cas9切割条带灰度值比值见图4，8号csgRNA在sgRNA4和sgFANCF位点上均显著降低Cas9-D10A的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果表明在sgRNA4和sgFANCF打靶位点上，8号csgRNA可明显降低APOBEC-3B对D10A进行基因编辑时产生的突变。

图4 csgRNA在Cas9 nickase上的作用效果

3 讨论

自从CRISPR/Cas9 系统被研究者成功开发出来，其广泛应用于生命科学研究[8-11]，但其临床应用（如基因治疗）一直受限于严重的脱靶效应[12-14]，因此进一步提高特异性是其临床应用的前提。本研究结果显示，在sgRNA4和sgFANCF位点上，csgRNA 策略对D10A/sgRNA系统有明显保护作用，而对H840A/sgRNA保护性无效果，这是因为H840A蛋白只有RuvC切割活性结构域，RuvC切割DNA非互补链，随后的缺口过程暴露的DNA互补链和sgRNA结合的双链结构占据主要部分，因此csgRNA策略主要降低APOBECs对D10A/sgRNA系统进行基因编辑时产生的突变；在对csgRNA条件进行优化时，发现较短的csgRNA保护性效果不佳，可能是因为D10A蛋白切割DNA单链后暴露的缺口过大造成的，这需要进一步验证。

科学家们在提高CRISPR/Cas9系统保真性方面付出了巨大的努力，如通过优化sgRNA的设计来提高CRISPR系统的保真性[15]、高保真性Cas9蛋白的开发[16]、利用Cas9-D10A结合双sgRNAs策略降低的脱靶效应的研究[17]等，但这些方法均不能有效抑制APOBECs对Cas9-D10A/sgRNA系统进行基因操作时引入的突变[5]。最近研究者将CRISPR-Cas9系统融合ArIIA4-Cdt1 表达元件，其在确保基因编辑效率的同时，可降低脱靶效应[18]，这是学者们在提高CRISPR系统保真性上的又一大进步。我们设想，将融合ArIIA4-Cdt1的CRISPR系统与csgRNA策略相结合，对APOBECs高表达的细胞进行基因编辑时，其保真性会进一步提高。

免疫细胞基因编辑在治疗人类各种疾病方面具有广阔的潜力[12，19-21]，然而免疫细胞中APOBECs高水平表达并且在细胞激活过程中APOBECs的表达持续上调[5，22]，这就使人们对免疫细胞进行基因编辑时更需谨慎。本研究为降低APOBECs对Cas9-D10A/sgRNA系统进行基因编辑时产生的突变提供了csgRNA策略，为其进一步向临床应用，尤其是对APOBECs高表达的初始T细胞进行基因编辑时，做出了一定的贡献。

综上，本研究通过csgRNA策略成功降低了 APOBECs对Cas9-D10A/sgRNA进行基因编辑时引入的突变，为提高CRISPR系统保真性提供参考。