UPLC-PDA法测定龙胆泻肝散中3种主要成分的含量

2021-10-16魏秀丽张志民张传津李有志王尚明

养殖与饲料 2021年10期

魏秀丽张志民张传津* 李有志强莉郭腾王尚明

1.山东省饲料兽药质量检验中心/山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室/动物源细菌耐药性监测与精准化用药山东省工程实验室，济南250022；2.山东省动物用中药制剂工程实验室，济南250100

龙胆泻肝散是一种中药散剂，是由龙胆、栀子、黄芩、柴胡、甘草、当归、车前子等10味药材粉碎而成的复方粉末，活性成分主要是龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷；方中以龙胆泻肝胆经实火，除下焦湿热为主药；辅以黄芩、栀子泻火清热，助龙胆清肝胆实火；泽泻、木通、车前子利尿，引湿热从尿而出，从而可助龙胆清利肝胆湿热；然而方中主辅药皆为苦寒之品，为使其不致苦燥伤阴，并防止肝胆火盛耗伤阴液，故加当归、生地养血益阴以和肝，这样配伍以达泻中有补，使邪去而不伤正，均为佐药；甘草和中协调诸药；柴胡疏肝胆之气，并用作引经药，皆为使药，诸药合用，而有泻肝火利湿热之效。功能主治：泻肝胆实火，清三焦湿热。主治目赤肿痛，淋浊，带下[1-2]。

在中国兽药典2015年版二部等文献对龙胆泻肝散等相关制剂中龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷均采用高效液相色谱方法[2-14]对含量进行测定，药典中检测采用梯度洗脱的方式，运行时间长，流动相用量多。本试验开发了超高效液相色谱-二极管阵列检测法（UPLC-PDA）对3 种主成分进行定性鉴别和含量测定，梯度洗脱所用的时间缩短90%以上，用来测定龙胆泻肝散中3 种主要成分的含量，精准快捷，绿色环保。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

龙胆苦苷对照品批号110770-201314，含量99.1%，购自中国食品药品检定研究院；栀子苷对照品批号110749-201316，含量97.5%，购自中国食品药品检定研究院；黄芩苷对照品批号z0271504，含量96.9%，购自中国兽医药品监察所；磷酸为优级纯，甲醇为色谱纯；所用水为超纯水；龙胆泻肝散，来自兽药企业报批产品。

1.2 仪器

Waters 2695 高效液相色谱仪；Waters AcquityTMUltra performance LC 超高效液相色谱仪；二者均购自美国waters 公司。

1.3 方法

1）供试品溶液的配制。严格按照中国兽药典2015年版二部龙胆泻肝散质量标准。

2）标准储备液的配制。精密称取龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷对照品适量，按照中国兽药典2015年版二部龙胆泻肝散质量标准，配制成含黄芩苷200µg/mL、龙胆苦苷160µg/mL 和栀子苷100µg/mL 储备液。

3）标准工作液的配制。取适量标准储备液，配制成系列标准工作液，见表1。

表1 标准工作液各成分浓度 µg/mL

4）色谱操作条件及参数。色谱柱采用waters公司CSH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 µm）；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸水溶液，按表2程序进行梯度洗脱（甲醇由12%逐步升高到55%，又逐渐下降到12%，均采取6 号曲线速度变化模式）；采用二极管阵列检测器，其扫描范围为190～400 nm，检测波长选择254 nm，柱温选择35 ℃，进样室温度10 ℃，流速为0.35 mL/min，进样量为1µL。

5）重复性试验和精密度试验。精密吸取龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷对照品储备溶液，制成含龙胆苦苷40µg/mL、栀子苷25µg/mL 和黄芩苷50µg/mL 的混合对照品溶液，重复配制6 份，上机测定，计算3 种成分峰面积RSD。精密吸取上述混合对照品溶液1 份，重复进样6 针，计算3 种成分峰面积RSD。

6）检测限和定量限的测定。对3种主要成分的混合标准工作液采用UPLC-PDA 进行检测分析，并倍比稀释成多个不同浓度，以溶液检测时的信噪比S/N≥3时作为检测限，S/N≥10时作为定量限。

7）不同色谱条件样品检测比较。使用超高效液相色谱仪（流速：0.35 mL/min；进样量：1µL）和高效液相色谱仪（参照中国兽药典2015年版二部[1]，流速：1.0 mL/min；进样量：10 µL）在不同的色谱条件下上机检测，对同一样品中龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的保留时间、峰面积和含量等参数分别进行比较。

2 结果与分析

2.1 色谱分离

在超高效液相色谱中，通过不断优化色谱，测得龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷色谱峰峰形对称，分离度良好，达到基线分离；在1.3 中4）条件下，龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷对照品和龙胆泻肝散样品，色谱保留时间分别约为4.9、5.5、9.7 min，分离度均满足要求。

2.2 线性

在优化的色谱条件下，采用梯度洗脱的方式，快速有效地分离主要成分的色谱峰，龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的线性良好。龙胆苦苷在16～160 µg/mL范围内标准曲线：y=3 652.8x+5 218，R2=0.999 4。栀子苷在10～100µg/mL 范围内标准曲线：y=2 897.6x+2 683.2，R2=0.999 5。黄芩苷在20～200 µg/mL 范围内标准曲线：y=5 844.5x+521 8，R2=0.999 4。理论塔板数：龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷均大于7 000，柱效良好。

2.3 重复性试验和精密度试验

配制含龙胆苦苷40µg/mL、栀子苷25µg/mL 和黄芩苷50 µg/mL 的混合对照品溶液，重复配制6份，进样，并计算龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷其峰面积RSD 分别为0.62%、0.64%、0.57%，完全满足试验要求。

取含龙胆苦苷40µg/mL、栀子苷25µg/mL 和黄芩苷50 µg/mL 的混合对照品溶液1 份，重复进样6次，并计算龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷其峰面积RSD 分别为0.36%、0.42%、0.55%，完全满足试验要求。

2.4 检测限和定量限

龙胆苦苷8 µg/mL、栀子苷5 µg/mL 和黄芩苷10µg/mL对照品溶液信噪比≥3定为检出限，龙胆苦苷16 µg/mL、栀子苷10 µg/mL 和黄芩苷20 µg/mL的对照品溶液信噪比≥10定为定量限。

2.5 不同色谱条件样品检测结果的比较

不同色谱条件下3 种化合物保留时间、理论塔板数、运行时间等参数的比较见表3。由表3 可知，使用waters 公司的CSH C18色谱柱保留时间短，理论塔板数也高，运行时间短，性能完全满足检测需求。

通过响应值比较及光谱图各成分的最大吸收波长分别为274.5、240.2、277.5 nm，由于3 种成分的波长相差较远，为了顾及三者化合物的响应，依然选择中国兽药典2015年版二部选择的254 nm 作为含量测定的检测波长。UPLC 对照品光谱图见图1，HPLC 对照品光谱图见图2；UPLC 对照品色谱图见图3，HPLC对照品色谱图见图4，不同批次的样品图见图5～图10。保留时间分别为4.9、5.5、9.7 min，满足实验室的检测要求。

图1 龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷对照品光谱图（UPLC）

图2 龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷对照品光谱图（HPLC）

图3 黄芩苷100µg/mL、龙胆苦苷80µg/mL和栀子苷50µg/mL对照品UPLC色谱图（1µL）

图4 黄芩苷100µg/mL、龙胆苦苷80µg/mL和栀子苷50µg/mL对照品HPLC色谱图（10µL）

图5 龙胆泻肝散1 UPLC 色谱图（1µL）

2 种试验色谱方法均已通过其方法学验证，均可以准确控制其指标成分。从检测效率和色谱图上看，本试验优选超高效液相色谱法，各色谱图见图3～图10。

图10 龙胆泻肝散3 HPLC 色谱图（10µL）

图6 龙胆泻肝散1 HPLC 色谱图（10µL）

图7 龙胆泻肝散2 UPLC 色谱图（1µL）

图8 龙胆泻肝散2 HPLC 色谱图（10µL）

图9 龙胆泻肝散3 UPLC 色谱图（1µL）

使用waters超高效液相色谱仪和普通高效液相色谱仪，对同一样品中3种化合物的含量测定结果分别进行比较，无显著差异，相对偏差均小于1.0%，表明本试验方法结果精准可靠，而且简单快速（表4）。

3 讨论

3.1 流动相的选择

本研究采用的甲醇和0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱，原药典方法[1]采用的是甲醇和0.2%磷酸水溶液，因为0.1%磷酸水溶液可以很好地达到分离要求，为了保护色谱柱，就选择了较低浓度的磷酸。

3.2 检测波长和流速、柱温的选择

本研究将龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的对照溶液利用PDA检测器采集其光谱图，在波长190～400 nm范围内进行扫描，龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷分别在274.5、240.2、277.5 nm 处有最大吸收，根据光谱图的波形变化可以判断其是否含有主成分。改变色谱柱柱温33、37 ℃，流速0.35 mL/min不变，保留时间上下浮动0.5 min以内；改变流动相流速0.34、0.36 mL/min，柱温35 ℃不变，保留时间上下浮动0.5 min以内，均能达到良好的分离度和精确的含量测定结果。色谱柱性能稳定，适合本项目3种目标化合物龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷含量的测定。最终选择254 nm作为检测波长，35 ℃柱温，不同条件下保留时间见表5。

3.3 流动相流速的比较

超高效液相流动相的流速为0.35 mL/min，需要运行14 min，每针运行需要4.9 mL 流动相，而且平衡和冲柱子的时间也大大缩短，检测1 个样品大约需要2.5 h；高效液相色谱仪器流速为1.0 mL/min，运行时间1 h，每针运行需要60 mL流动相，平衡色谱柱和洗脱色谱柱的时间都很长（大约各需要1 h），检测1 个样品大约需要10 h。超高效液相色谱更节约试验耗材溶剂等，每运行1 针节省55 mL 流动相，超高效液相色谱方法产生废液少，更环保和快捷。

3.4 本方法与药典方法的结果对比

本试验针对3个企业批次的龙胆泻肝散进行含量检测，分别采用超高效液相色谱方法和高效液相色谱方法，龙胆泻肝散和龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷含量相对偏差均小于1.0%，2批次合格，1批次不合格。企业可以根据快速的检测结果，返工查找不合格的原因，查找是药材不合格还是混合不均匀等因素导致的。本方法运行1针需要14 min，比药典方法60 min节约时间46 min，提高了检测效率。本方法高效快速准确可行。