支气管哮喘患者血清MicroRNA-145水平表达与肺功能、气道重塑及Th1/Th2平衡的关系分析

李 颖，任炳臣，韩晓庆，王永红，赵京梅，李 静，王海静，肖 宁，何洪英

（1.邯郸市中心医院 呼吸内科一病区， 河北邯郸 056001;2 邯郸市第一医院院前急救，河北邯郸 056002;3.河北省华北理工大学附属医院呼吸内科， 河北唐山 063000）

支气管哮喘（bronchial asthma，BA）的发生机制比较复杂，临床认为是免疫因素、炎症介质等相互作用所致的结果，而辅助性T 细胞1/辅助性T 细胞2（helper T cell 1/helper T cell 2，Th1/Th2）失衡与炎症介质密切相关[1]。Th1 细胞能够分泌干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白介素-2（interleukin-2，IL-2）等因子，促使巨噬细胞活化，对机体免疫、炎症有调节作用，Th2 细胞能够分泌白介素-4（interleukin-4，IL-4），白介素-13（Interleukin-13，IL-13）等因子，具有促炎作用[2]。通常Th1 和Th2 细胞处于平衡状态，一旦二者失衡，易引起气道炎症疾病，以BA 最常见[3]。气道重塑在哮喘中呈进行性发展，可加重气道壁形态异常，致病情进展为重度哮喘，随着哮喘程度加重，对肺功能的影响也越大[4]。既往对这类患者给予激素治疗，但部分病人治疗无效[5]，因此临床需寻求可靠调控因子，明确新的干预靶点。近年来，有学者发现微小核糖核酸-145（micro ribonucleic acid-145，microRNA-145，简称miR-145）基因可能参与了肺损害气道高反应的病变过程，与慢性阻塞性肺疾病有关[6]。而该病和哮喘有诸多相似之处，因此miR-145 可能也参与了哮喘进展过程，但目前哮喘患者miR-145 的表达水平及其在哮喘发生发展中的作用机制尚不清楚，临床仍需大量研究对此予以论证，鉴于此，本研究拟探讨BA 患者血清miR-145 表达水平与肺功能、气道重塑、Th1/Th2 的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 纳入邯郸市中心医院2018年7月～2020年7月收治的BA 患者90 例作为BA 组，另选取同期于邯郸市中心医院体检的62 例健康志愿者作为健康组。研究方案获得邯郸市中心医院伦理委员会批准。纳入标准：①BA 组：满足中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的《支气管哮喘防治指南(2016年版)》中的相关标准[7]，年龄≥18岁；急性发作期病例；初诊病例；能配合完成相关检查；精神状态、认知功能正常；知情同意。②健康组：性别、年龄等基线资料与BA 组匹配；身体健康状况良好；能配合完成相关检查；精神状态、认知功能正常；知情同意。排除标准：因肺炎、肺间质性疾病等其他因素所致的喘息、咳嗽等症状者；自身免疫性疾病者；恶性肿瘤者；入院前三个月内有激素药物、解痉平喘治疗史者；肝、肾、心等脏器严重受损者；危重症者。BA 组男性47 例，女性43 例，年龄23～45 岁，平均年龄33.94±8.75 岁；并发过敏性鼻炎4 例；并发过敏史3 例；体质量指数18～24kg/m²，平均年龄22.15±1.41kg/m²；并发吸烟史16 例；并发饮酒史18 例；并发家族遗传史15 例。健康组男性34 例，女性28 例，年龄22～48岁，平均年龄31.65±9.02 岁；并发过敏性鼻炎1例；并发过敏史1 例；体质量指数18～24kg/m²，平均22.89±1.64kg/m²；并发吸烟史10 例；并发饮酒史13 例；并发家族遗传史9 例。两组基线资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 仪器与试剂 主要仪器为高速离心机（山东博科集团，TG-16W），恒温箱（北京福意电器，FYL-YS-430L）， 荧光PCR 板（Roche 罗氏，4729692001 96 孔板），电泳仪（济南来宝医疗器械，DYY-6D），紫外分光光度计（上海屹谱仪器制造有限公司，U-T6A）。主要试剂为Trizol 试剂盒（无锡百泰克生物），琼脂糖（北京中科瑞泰生物）、引物（经上海生物工程设计）。

1.3 方法 受试者在就诊或体检当日，接受相关检查与指标检测。血清miR-145：在受试者空腹状态下，采集肘静脉血3ml，行离心处理，时间为10min，转速3 000r/min，分离血清，存放于-70℃环境待测。经实时荧光定量-聚合酶链式反应（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测，利用Trizol 试剂盒提取总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA 纯度，采用Stem-loop 法行miRNA 逆转录合成cDNA，将该反应液经qRT-PCR 法予以检测，扩增反应条件为95℃预变性10min，95℃变性10s、50℃退火50s、72℃延伸30s，共40 个循环，以U6作为内参引物。引物序列：（1）miR-145：正向引物为5’-CCTCACGGTCCAGTTTTCCC-3’，反向引物为5’-GCAAATCCAGCTGTGAAACCA-3’；（2）U6：正向引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，引物经上海生物工程设计。待扩增反应完毕，按照每间隔5s 增加1℃的条件，继续加热至99℃，建熔解曲线，经2-△△Ct表示血清miR-145 相对表达量。肺功能检测：利用涵飞医疗（上海）S-980A I 肺功能检测仪测定1 秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second，FEV1），用力肺活量（forced vital capacity，FVC），峰值呼气流速（peak expiratory flow，PEF），最大呼气中期流量（maximal mediate expiratory flow 75/25，MMEF75/25）， 并计算FEV1与FVC 的比值，即FEV1/FVC。气道重塑指标：经德国西门子Sensation 64 高分辨率CT 进行测定，选用薄层技术，层间距、层厚均为1.0mm，扫描电压、矩阵分别为120MV，512×512，通过骨建法行重塑，受试者均接受深吸气、深呼气末屏气相扫描，各层面取两个清晰影像行气道测量，各部位取均值作为最终结果，内容包括气道总面积（total airway crosssectional area，Ao）、气道腔面积（area of airway，Ai）、气道外径（external diameter，D），气道内径（lumen diameter，L），从而计算支气管管壁厚度与外径比值（airway wall thickness/External diameter，T/D），气道壁面积占气道总截面积百分比（Percentage of wall area，WA%）。T/D=[（D-L）/2]/D，WA%=（Ao-Ai）/Ao×100%。Th1，Th2，T 细胞亚群[T cell subsets1（Tc1），T cell subsets2（Tc2）]及IFN-γ，IL-4 检测：在受试者空腹下，取4ml 肘静脉血，分装于两管，每管各2ml，一管经美国贝克曼库尔特CytoFLEX 流式细胞仪检测外周血Th1，Th2 细胞以及Tc1，Tc2 细胞，另一管行离心处理，2 500 r/min离心15min，离心半径8cm，取血清存放于低温冰箱待测，经酶联免疫吸附试剂盒（上海仁捷生物）测定血清IFN-γ，IL-4 水平。

1.4 统计学分析 使用SPSS23.0 进行研究资料分析。观测资料中的计量数据，均通过正态性检验，以均数±标准差（±s）描述。两组间的比较，方差齐同为成组t检验，方差不齐同为校正t检验（统计量为t）。计数资料以例数及率描述。两组间比较为卡方检验或校正卡方检验（统计量为χ2）。各指标间的相关分析为Pearson 相关检验。统计推断的检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组血清miR-145 表达水平及肺功能指标比较 见表1。BA 组血清miR-145 表达水平高于健康组，而FEV1，FVC，PEF，MMEF75/25和FEV1/FVC 均低于健康组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 两组血清miR-145 表达水平及肺功能指标比较（±s）

表1 两组血清miR-145 表达水平及肺功能指标比较（±s）

项 目BA 组（n=90）健康组（n=62）tP miR-145（2-△△Ct）2.98±0.491.32±0.2527.3800.000 FEV1（L）1.66±0.282.37±0.3114.7040.000 FVC（L）2.65±0.473.38±0.697.7620.000 PEF（L/s）5.34±1.266.45±1.027.2520.000 MMEF75/25（L/s）0.43±0.071.39±0.1256.6960.000 FEV1/FVC（%）62.64±3.9770.12±6.518.0720.000

2.2 两组气道重塑指标比较 见表2。BA 组D，Ao，T/D，WA%均显著高于健康组，差异有统计学意义（均P＜0.05），两组L，Ai 比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表2 两组气道重塑指标比较（±s）

表2 两组气道重塑指标比较（±s）

项 目BA 组（n=90）健康组（n=62）tP L（mm）2.64±0.512.66±0.460.2470.805 D（mm）4.84±0.414.47±0.375.6870.000 Ao（mm²）22.39±5.3514.62±3.6410.6560.000 Ai（mm²）5.43±1.195.01±1.881.5570.123 T/D（%）22.73±0.7120.25±0.6521.8970.000 WA（%）75.75±7.5465.73±6.388.5610.000

2.3 两组Th1，Th2，Tc1，Tc2 细胞及血清IFN-γ，IL-4 比较 见表3。BA 组Th1，Th1/Th2，Tc1，Tc1/Tc2 和IFN-γ 均低于健康组，而Th2，Tc2 和IL-4较健康组显著升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 两组Th1，Th2，Tc1，Tc2 细胞及血清IFN-γ，IL-4 比较（±s）

表3 两组Th1，Th2，Tc1，Tc2 细胞及血清IFN-γ，IL-4 比较（±s）

项 目BA 组（n=90）健康组（n=62）tP Th1（%）0.50±0.110.79±0.1513.0040.000 Th2（%）0.84±0.270.58±0.128.0540.000 Th1/Th20.59±0.081.36±0.3119.1240.000 Tc1（%）14.04±1.7630.61±6.5722.7990.000 Tc2（%）10.06±3.253.48±0.4515.8220.000 Tc1/Tc21.40±0.328.79±2.7625.1940.000 IFN-γ（pg/ml）19.97±4.4533.43±5.5216.5980.000 IL-4（ng/ml）18.41±4.897.31±1.5420.1340.000

2.4 BA 患者血清miR-145 表达水平与肺功能、气道重塑及Th1，Th2，Tc1，Tc2 的相关性 经Pearson 线性相关分析显示，血清miR-145 表达水平与FEV1，FVC，PEF，MMEF75/25，FEV1/FVC，Th1，Th1/Th2，IFN-γ，Tc1 和Tc1/Tc2 呈负相关（r=-0.612，-0.403，-0.490，-0.534，-0.558，-0.537，-0.619，-0.591，-0.711 和-0.619， 均P＜0.05）， 而其与D，Ao，T/D，WA%，Th2，IL-4 和Tc2 呈正相关（r=0.577，0.556，0.416，0.409，0.542，0.508 和0.624，均P＜0.05），血清miR-145与L，Ai无相关性（r=0.305，0.319，均P＞0.05）。

3 讨论

BA 是由肥大细胞、中性粒细胞、T 淋巴细胞等多种细胞因子参与的一种呼吸系统疾病，大部分患者既往有哮喘家族史[8]。研究表明在哮喘发病过程中，CD4+T 细胞发挥了重要作用，其受抗原刺激后，可分化Th1 和Th2 细胞亚群，而Th1 和Th2细胞亚群失衡可能参与了哮喘炎症的进展过程[9]。近年来，研究发现BA 发病可能与miRNA 表达有关，其可能通过影响炎症因子释放参与BA 的病理改变[10]。哮喘患者伴有明显的气道病理改变，具体表现为气道上皮增厚、支气管腺体肥大、气道平滑肌细胞增殖等，能引起气道高反应[11]。研究认为miRNA-145 与气道高反应性发生有关，但作用机制不明确[12]。鉴于此，临床可考虑观察BA 患者血清miR-145 表达水平变化，以便进一步了解病情，提出针对性治疗方案。

本结果显示BA 患者的血清miR-145 表达水平增高。炎症反应促进了BA 进展，例如IL-4，IL-13 等炎症介质大量释放，能通过对B 细胞进行刺激，致抗体免疫球蛋白M 与免疫球蛋白E 生成，加重气道高反应[13]。miR-145 是高度保守的一种miRNA，小鼠实验[14]提示其能调控细胞免疫以及炎症进展，对IL-1，IL-6 等因子有调控作用，表明miR-145 可能通过调控炎症因子水平参与疾病进展，但该研究发现miR-145 对炎症反应有抑制作用，与本次结论相悖。该研究主要探讨miR-145 与动脉粥样硬化的关系，与本研究所讨论的疾病类型不同，提示miR-145 在不同疾病中的表达与作用存在特异性。孙海霞等[15]发现BA 患者的血清miR-145 表达水平较体检者增高，与本次结论吻合。本研究还提示BA 患者存在肺损害。肺损害在哮喘中较常见，在哮喘发作过程中有炎症介质参与，可引起气道高反应，致黏膜充血、气道分泌物增加，削弱气道上皮屏障功能，从而致病菌侵袭肺部，导致肺功能下降，哮喘严重程度与肺损害程度、气道高反应严重度密切相关[16]。因此，临床必须重视对BA 患者进行肺功能检测。

气道重塑是BA 患者的常见表现，本次结果提示BA 患者的D，Ao，T/D 和WA%均增高，表明其存在明显气道重塑。BA 患者的气道重塑主要集中于肌层以及外膜气道壁，可引起形态学、组织学改变，致气道狭窄，且具有不可逆性，尽早发现、评估气道重塑，对改善预后有益。D，Ao，T/D 和WA%是评估气道重塑的常用指标，其中WA%能对气道重构给予直观、准确判断，尤其在判断气道狭窄中敏感度高，哮喘程度越重，则WA%值越高，D，Ao 和T/D 对气道重塑的评估敏感性均较高，能反映气道反应性程度，气道反应性越重，则D，Ao和T/D 值越高[17]。本研究还发现BA 患者的Th1/Th2 和Tc1/Tc2 处于失衡状态。IL-4 是Th2 和Tc2的生成因子，它可促进B 细胞分化、增殖，有效抑制这类细胞的凋亡，还可对嗜酸性粒细胞凋亡进行抑制，致该类细胞数目增多，使炎症机制启动，发挥促炎作用[18]。IFN-γ 则是Th1 和Tc1 的生成因子，它对Th2 和Tc2 释放促炎因子有抑制作用，可抑制炎性浸润[19]。一旦Th1，Tc1 细胞受抑制，Th2，Tc2 细胞过度活跃，则会导致促炎因子大量释放，而抑炎介质的释放减少，促进BA 进展。

血清miR-145 表达水平与FEV1，FVC，PEF，MMEF75/25，FEV1/FVC，Th1，Th1/Th2，IFN-γ，Tc1 和Tc1/Tc2 呈负相关，与D，Ao，T/D，WA%，Th2，IL-4 和Tc2 呈正相关。其中IL-4 过表达能使Th2 细胞直接活化，加重气道高反应与肺损害，而miR-145 能调控IL-4 的表达，其过表达可致炎症程度更重，miR-145 过表达可能通过上调IL-4促进BA 患者的肺损害。蓝英等[20]研究提示哮喘患儿的Runt 相关转录因子3（RUNX3）mRNA 表达水平下降。而另有学者指出，miR-145有促炎作用，Th2 生成的促炎因子能刺激miR-145 表达，且mi-R145 表达能通过靶向调控RUNX3 而调节哮喘病人的Th1/Th2 失衡状态，在miR-145 表达受到抑制后，则可纠正该失衡现象[21]。由此可见，mi-R145 靶向调节RUNX3 可能是参与哮喘病情进展的重要机制。Tc2 有促炎作用，Tc1 有炎症抑制作用，而miR-145与Tc2 作用相似，也具有促炎作用，其可能通过共同作用，参与BA 患者病情进展。

综上所述，BA 患者的血清miR-145 表达水平增高，其过表达对患者肺功能、气道重塑、Th1/Th2 细胞影响较大，可促进Th1/Th2 失衡，临床可通过测定血清miR-145 表达进一步了解BA 患者病情。本研究的局限性为选取样本较少，且未分析不同BA 严重程度患者血清miR-145 水平的变化，未来还需增加样本量，进一步分析BA 严重度与miR-145 的关系，更加深入阐述miR-145 对BA 的影响。