数字聚合酶链反应(dPCR)技术在病原体基因检测应用中的研究进展

唐月明，伊 洁

（中国医学科学院北京协和医院检验科，北京 100730）

在许多感染性疾病中，病原体的量化已经被证明是一项有用的预后指标和监测治疗反应的重要参考。实时荧光定量多聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）作为二代核酸检测方法，已在实验室被广泛使用。它通过在反应体系中加入荧光标记的探针来实时检测荧光信号，借助荧光曲线的循环阈值（cycle threshold，Ct）和标准曲线来定量起始靶基因的浓度，为相对定量技术。这种方法能有效测定对数拷贝数，动态范围宽，但由于很多因素都会影响qPCR 的效率，比如在低拷贝靶分子（如病原体本身含量低或者部分患者在检测前已使用抗生素治疗）、复杂模板背景（如大量人基因组会干扰引物和探针的特异度反应、qPCR 抑制物存在）、扩增效率低下（靶基因具有多态性却使用统一的探针及引物）、探针保存不当导致部分降解、标准品和标准曲线偏斜等情况下，其Ct值都会受到影响，因此qPCR 的准确度和精密度可能会有很大的差异[1]。除此之外，缺乏绝对定量值来校准标准品，导致qPCR 结果不精密度高及各实验室之间的可比性差。所以qPCR 作为临床常规检测技术存在不足之处，尤其是在复杂背景下检测低含量的靶基因时，需要更加敏感和稳定的方法检测。数字聚合酶链反应（digital PCR，dPCR）作为一种新的准确定量技术，在基因的绝对定量检测中得到广泛应用，尤其是对微量样本的绝对定量。

现将dPCR 技术的特点、优势及在病原微生物检测中的应用综述如下。

1 dPCR 简介

1999年VOGELSTEIN 等[2]采用96 孔板对样本进行了微升级别的PCR 扩增，从而提出了dPCR的概念。随着技术的进步，dPCR 近年来逐渐兴起，成为一种新的分子生物学诊断技术，其将微量样品作大倍数稀释和分液，实现理论上的单分子扩增，然后用终点法PCR 和统计学中的柏松分布原理计算出样品的原始浓度[1]。

dPCR 根据样品分散模式不同分为磁珠模式、微滴模式和芯片模式，后两者更为常见。其中微滴模式是随着纳米制造技术和微流体技术发展起来的新模式，也叫微滴式dPCR（droplet digital PCR，ddPCR）。它的原理是微滴发生器将PCR 反应混合液通过打散并制成数万个皮升级大小的油包水液滴后进行PCR 反应，每个微滴中会含有一个或者不包含目标分子，每个微滴内的PCR 反应在相对独立的环境里独自反应，反应完成后，通过对每个微滴进行荧光检测，含有荧光信号的微滴确定为阳性，不含荧光信号的微滴确定为阴性。对微滴进行计数，可以准确得出含有目标分子的微滴数和不含目标分子的微滴数，同时可以以一维图或二维图呈现检测结果。每微升的目标数是使用一个包含阳性微滴数、总微滴数和微滴体积的公式来计算的[3]。随着浓度的增加，单个反应体系可能包含2 和/或多个目标模板分子，这时能够通过泊松分布进行校正，从而计算出样品中靶分子浓度，实现绝对定量。芯片模式即芯片PCR（chip dPCR，cdPCR），是由物理隔离的腔室组成，在微孔中进行PCR 扩增反应。因此，检测芯片扩增的荧光可以代表阳性反应和阴性反应的数量。根据样品分布方法不同进一步分为基于微孔的毛细力驱动样品分散模式、基于通道的样品分散模式、基于水凝胶珠的样品分散模式和基于喷墨的样品分散模式[4]。

2 dPCR 技术的优势

2.1 更高的敏感度和精密度 因为dPCR 将样本分成若干小PCR 反应分区，可实现单分子级检测，避免了模板间的竞争效应，理论上可以提高低丰度目的序列的检测敏感度，也有实验证实[5]，dPCR 在测量某些病原体时具有更高的敏感度。由于dPCR较少受到扩增效率的影响，并且采用终点法定量，因此具有更高的精密度和准确性[3,6-7]。

2.2 更高的重复性和通用性 dPCR不依赖标准品，不需要标准曲线，也不依赖荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，直接计算样品中目的核酸分子的个数，可实现绝对定量，重复性和通用性高[8]，因此dPCR 可用于给常规qPCR 所需的标准品定量，具有计量学意义[6]。

2.3 更高的抗干扰能力和稳定性 QUAN 等[9]系统比较了十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）、乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA）及肝素等常见PCR 抑制物对ddPCR 和qPCR 的影响，结果显示，ddPCR对SDS 和肝素的耐受程度高于qPCR，但是抗EDTA 的表现并不突出。NIXON 等[10]人也发现cdPCR 对乙醇和血浆抑制作用的敏感性较低，但是对EDTA 依旧敏感。dPCR 耐受能力高的可能原因包括：在ddPCR 中，样品被分割成许多微小的反应区，这提高对缓蚀剂的抵抗力[7]；用于生成液滴乳液的油可能将一些抑制物质从水相PCR 反应中分离出来；qPCR 是依赖每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数来进行定量，dPCR 是终点法而不是实时扩增进行定量，因此较少收到样本中可能存在的抑制物的影响[1]，可以应用在复杂临床样本（血液、粪便和组织等）中的病原微生物或其他标志物的检测[11]，通用性更高。

3 dPCR 技术的应用

3.1 低载量病原微生物的DNA 检测 优越的精密度和敏感度使dPCR 可用于低载量致病微生物的早期检测及治疗的后续监测，提供客观和量化的判断阈值。USHIO 等[12]利用dPCR 成功地在肺结核患者的血浆样本中检测到结核杆菌DNA，并提出这种微创、快速和准确的循环检测结核杆菌 DNA 的方法有可能成为一种新的标准诊断方法，辅助结核早期确诊。关于dPCR 检测人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）相关癌症患者血清中HPV DNA 的研究表明，可以使用这种高灵敏度的技术进行亚临床肿瘤肿块的生物学检测,例如早期浸润癌、微小残留或早期复发的肿瘤监测[13]。STRAIN 等[9]论证并提出dPCR 的高敏感度和精密度有助于测量潜伏中的HIV 病毒进而能够及时干预，达到早期消除的目的。2013年，PERSAUD 等[14]对1 例感染HIV 的婴儿从出生后30 h 至18 个月时期进行联合抗反转录病毒治疗，在停止治疗后，分别在婴儿24个月和26 个月的时候，使用ddPCR 检测婴儿血液中HIV DNA 水平，检测发现婴儿体内细胞相关的HIV-1 DNA 几乎完全消失，残存片段不具备复制能力。2020年，英国学者[15]用ddPCR 等核酸检测方法对接受了异基因干细胞移植，并且中断分析治疗18 个月的病人进行了HIV-DNA 的检测，ddPCR 被用来检测肠道活检和淋巴结组织的细胞。结果显示，该病人在各基质中均没有检测到具有复制能力的病毒，因此认为这些发现代表了HIV 患者的治愈。可见，dPCR 优越的检测能力在HIV 治疗后监测中起到了关键作用。

关于人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,CMV）的研究发现，CMV 病毒载量从200 copies/ml以下增长到200 copies/ml 以上时患者会出现明显的症状[16]，能够检测CMV 载量的微小变化在临床上具有明显的意义，因此dPCR 在CMV 的研究领域中被广泛使用。QUAN 等[9]发现qPCR 比ddPCR有更高的敏感度，但是该研究中qPCR 和ddPCR 的初始DNA 模板量不等，因此可能导致ddPCR 敏感度下降。在优化试验后发现，ddPCR 在敏感度相同的情况下，批间精密度和批内精密度都更高，这种优势有利于体内CMV 的持续检测[17]。在其他基质中，也有研究者用dPCR 对CMV 进行绝对定量：CAO 等[5]用dPCR 技术对60 例青光眼睫状体炎综合征患者的房水进行检测，发现27 例CMV 阳性，而qPCR 法仅发现20 例阳性，二代测序验证结果与dPCR 检测结果完全一致，其证明dPCR 的高敏感度更适合用于房水样本中微量病毒的检测，可以避免重复的有创操作。dPCR 是近年来在寄生虫学中应用的一项强有力的技术，在恶性疟原虫和日本血吸虫中显示出明显优于qPCR 的优势，在无症状和低密度感染中，dPCR 可能成为检测寄生虫血症的首选方法[18]。

理想的精密度使得dPCR 可用于测量高拷贝数和低拷贝数目标基因的扩增比率。人类疱疹病毒6型（human herpesvirus 6，HHV-6）能够潜伏感染大多数成人。在大约1% 的人群中，HHV-6 能够整合在人类染色体上（chromosomally integrated human herpesvirus 6，ciHHV-6），并通过生殖系统传播。在检测活动性HHV-6 感染时，遗传了ciHHV-6 的患者经常被误诊产生不必要的治疗和副作用。SEDLAK 等[19]运用dPCR 通过精确测定HHV-6 和人DNA 的比率来快速准确地鉴定ciHHV-6 的方法。遗传了ciHHV-6 的个体HHV -6/人细胞比例为1:1。在造血细胞移植的背景下对这些人进行识别有助于解释HHV-6 检测的阳性结果，并可能避免使用抗病毒药物进行不必要的治疗。该团队还在随后的研究中建立了新的dPCR 方法能够识别是哪一种亚类-HHV-6A 或者HHV-6B。

3.2 低载量病原微生物的RNA 检测 dPCR 也被用于RNA 的定量检测。乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV) RNA 是一种反映共价封闭环状DNA活性的新标记。然而，检测HBV RNA 的方法一直是一个技术挑战。LIMOTHAI 等[20]人比较了逆转录ddPCR（reverse transcriptase droplet digital PCR,RT-ddPCR）和逆转录qPCR（reverse transcriptase quantitative real-time PCR,RT-qPCR）对不同治疗阶段的慢性乙肝患者血清的HBV RNA 检测，结果显示RT-ddPCR 在所有浓度的 RNA 定量一致性方面均优于RT-qPCR，可以提高血清RNA 的检测敏感度，成为HBV RNA 定量的最佳方法。dPCR 也被用于检测细菌核糖体RNA，结合测序技术，对危重病人肺微生物群进行定量和表征，辅助分析危重病人预后与入院时肺微生物群特征的关系[21]。在2020年造成全国紧急公共卫生事件的新型冠状病毒-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，Sars-Cov-2）的检测中，ddPCR 展现出其在低载量病毒检测中的优越性。LIU 等[22]人建立了ddPCR的临界值，为40 copies/ml，显著低于目前常用qPCR 的检测下限（1 000,500 copies/ml 等）。同时实验证明，ddPCR 对确诊病人的拭子检出阳性率高于qPCR[23]，在qPCR 阴性的出院患者样本中仍检测出了Sars-Cov-2 的存在[22,24]，表明ddPCR 有助于减少假阴性结果的发生，降低了病毒传播的潜在风险。此外，ddPCR 可以报告病毒载量的具体数值，可用于动态监测患者的SARS-CoV-2 病毒载量，利于病毒载量与预后关系的研究。

3.3 基因多态性的检测 dPCR 不仅可以对低载量病毒绝对定量，还可在200 000 个野生型病毒中定性检测出变异病毒，检测限达0.005%，而qPCR 和焦磷酸测序法只能检测高于10%的突变基因[25]。由于基因组的高度多样性，引物或探针的不匹配可能会降低扩增或探针水解的效率，在这种情况下，qPCR 可能大大低估了真实的模板拷贝数，利用病原体DNA 序列数据定制患者特异性引物和探针可以解决此问题，但是该方法繁琐，可行性差。dPCR 由于不依赖于扩增效率，而扩增效率会受到引物或探针结合区序列失配的影响，因此，dPCR比qPCR 具有更高的准确性，可用于基因组多态性的突变检测，包括稀有突变、单碱基突变及拷贝数的变异。已报道的利用dPCR 技术定性检测序列多样性高的病原体包括结核杆菌[12]、BK 病毒（BK virus,BKV）[26]、JC 病毒（JC virus,JCV）[27]等。在此基础上利用dPCR 检测变异的耐药菌株，对用药的疗程管理和疗效预测有十分重要的意义。利用dPCR 已能成功区分对甲氧西林耐受或者敏感的金黄色葡萄球菌[28]。ABRAM 等[29]人证明dPCR 技术可以直接从全血中识别携带特定耐药基因的病原体并且具有100% 的敏感度和特异度。

3.4 标准品绝对定量值的建立 美国国家标准与技术研究所采用dPCR 对CMV 进行了绝对拷贝数的测量，这也是第一次采用dPCR 建立标准,并根据精确确定的已知扩增DNA 分子数来进行不同实验室的方法校准验证和质量控制[30]。此后dPCR 陆续被用于CMV 的qPCR 标准品的定值[31]。dPCR 在对WHO 国际标准物质的拷贝数异质性鉴定中也起到了一定作用。例如，由于T 抗原等区域的大范围不同缺失，导致多瘤病毒基因组不同位点之间拷贝数显著差异，会导致定量结果显著不同，利用dPCR对WHO 关于BKV 和JCV 的国际标准进行测定发现定量结果可相差8 倍，这一发现经下一代测序证实是由于该国际标准中存在多个病毒亚群[26-27]。

3.5 不同基质中病原微生物的检测 dPCR 具有比qPCR 更高的抗干扰能力和稳定性，对不同基质的抑制作用更强，在粪便组织检测幽门螺杆菌[32]、石蜡包埋组织检测HBV[11]中表现出优越的灵敏度和特异度，在鼻咽拭子、痰液、尿液、精液等其他基质中也有应用[5,23,33-34]，便于研究者对致病微生物进行研究，能够帮助病人获得早期诊断。

3.6 其他新兴应用

3.6.1 多重dPCR 检测:ddPCR 实现了CMV，人腺病毒（human adenovirus,ADV）的多重DNA 检测，并对粪便中两种病毒进行了分析，灵敏度均高于同时进行检测的qPCR，保证了易受抑制的临床标本的准确测定，防止了假阴性[11]。

3.6.2 为高通量测序技术提供灵敏校准:DING 等[35]使用dPCR 精确定量测序模板，使测序文库在没有预扩增的前提下对样品需求体积减少了1 000 倍以上至皮克级，同时消除了构建标准曲线带来的不确定性，最大限度的减少了偏倚，成功地对低于纳克级的细菌和哺乳动物的DNA 样品进行了测序。EASTBURN 等[36]人引入了微流控液滴富集技术，将5 个不同基因组位点的靶基因富集了31.6 倍，应用dPCR 技术实现了测序文库的绝对定量，且大大降低了样本用量、测序成本和时间。将下一代测序方法与dPCR 联合使用可被视为未来病毒学领域应用的发展趋势,能够更全面识别目标基因座内的遗传多态性。

3.6.3 免除核酸提取，减少工作流程:PAVSIC等[31]分别用两个不同的dPCR 平台（Bio-Rad 和Biomark）分别对病毒DNA 进行免提取及提取后dPCR 定量分析，结果表明两种平台的免提取方法测得浓度与实际病毒载量更接近。这是第一份免DNA 提取进行dPCR 直接定量的研究。免DNA 提取进行病原微生物定量将大大减少工作流程，提高工作效率，节省临床周转时间，但是仍然需要对其他病毒、参考物质和临床相关基质进行验证。在此基础上，ddPCR 也被用于直接从全血样本中进行细菌鉴定和抗生素敏感性分析，为血液感染和抗生素耐药早期指导和适当治疗提供快速诊断[29]。

3.6.4 与多种扩增技术整合:将数字技术同其他扩增技术整合的模式比如数字环介导等温扩增技术（digital loop-mediated isothermal amplification,dLAMP）和数字重组酶聚合酶扩增技术（digital recombinase polymerase amplification,dRPA） 也有报道。dLAMP 易于组装和操作的特点，可以在没有预处理设备、辅助仪器或控制系统的情况下形成坚固的液滴。研究者利用dLAMP 定量HPV[37]，发现虽然敏感度低于dPCR，但其定量性能及抗抑制剂性能均优于qLAMP，后者无法对1 000 copies/ml以下的核酸进行定量[10]。而GORGANNEZHAD 等[38]人描述的一种微流控dRPA SlipChip 是利用RPA替代dPCR 所需要的温度循环，通过在每个反应室中添加一个化学引发剂，只需简单的滑动步骤，即可同时引发1 000 多个纳升规模的RPA 反应。经过验证，该模式与相同SlipChip 基础上的dPCR 性能相当。

4 小结与展望

dPCR 虽具有更高的敏感度、重复性和稳定性，也已在相应领域获得了应用，但是该技术在未来能否广泛应用仍具有许多挑战。

4.1 通量低 qPCR 可同时检测96 个样本甚至更多，但是cdPCR 的每张芯片上最多分析48 个样品，ddPCR 则更少，因此应增加检测通量，以降低临床周转时间。

4.2 灵敏度需提高 增加单样本反应分区数和荧光通道数量或改进荧光编码的方法，可以进一步提升检测灵敏度甚至同时检测多种靶标。

4.3 检测范围受限 由于dPCR 需要单分子级检测，在不同浓度下需要不同的稀释方法，尤其是高浓度下增加稀释分区以确保仪器不饱和。

4.4 RNA 定量易受影响 虽然dPCR 被广为应用于核酸的检测，其在RNA 定量检测领域仍是需要不断发展的，目前看仍然是依赖于转录效率和检测效率的。在进行RNA 定量时，由于逆转录酶和引物等因素影响，导致逆转录过程不完整，使得cDNA 与原始RNA 拷贝数目不一致；或者由于分子丢失效应，比如在反应孔中同时添加逆转录反应体系和cDNA 扩增体系，扩增体系受到抑制，导致不是所有模板都被扩增，因此对RNA 定量不准确。

4.5 价格昂贵 dPCR 未来应降低成本以解决因实验成本昂贵而无法普及的现状。

4.6 不同厂家间结果互通性仍需提高 虽然dPCR是绝对定量，但是不同厂家使用的不同试剂和平台检测结果仍然不一致，已有研究者采用三套PCR试剂和两个dPCR 平台进行CMV DNA 的检测，发现结果存在差异[39]，对检测到的假阳性信号，值得进一步研究。

综上所述，虽然dPCR 技术在达到普遍应用的道路上仍然存在许多不足与挑战，但是其不需要标准曲线，以绝对定量的优势，对低拷贝核酸，尤其是缺乏标准品的病原体的检测和定量提供了一种新的发展方向，dPCR 技术的进一步发展也会更利于病原体的诊断、治疗及耐药分析监测等。但其检测结果特别是极低检测下限在临床中的实际应用价值尚需进一步通过更多的研究证明。