多发性骨髓瘤早期实验诊断相关新兴生物标志物的最新研究进展

徐海燕，陆学东

（中山大学附属第八医院医学研究中心，广东深圳 518000）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是骨髓中浆细胞恶性增殖并伴有单克隆免疫球蛋白分泌为特点的疾病，其发病率占所有血液系统恶性肿瘤的10%[1]，严重危害人群健康。虽然传统的实验诊断相关生物标志物很多，但敏感度和特异度较低，很难对MM 进行早期诊断和早期干预，即使MM治疗方法不断革新，但MM 的生存及预后仍不理想。随着研究的进展，一些新的生物标志物被证明可预测早期MM 的疾病进展，有利于MM 的早期诊断和后续的靶点治疗。本文就近年来发现的一些潜在的MM 早期实验诊断相关生物标志物进行综述，为提高MM 的临床诊断率提供理论基础。

1 MM 的主要临床表现

MM 的疾病进展包括了两个重要的前期阶段，即意义不明的单克隆丙种球蛋白病（monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS）和冒烟型多发性骨髓瘤（smoldering multiple myeloma,SMM）。MGUS 进展为MM 的速度约为每年1%，SMM 是介于MGUS 和MM 之间的恶性临床前阶段，其进展率约为每年10%[2]。MM 恶性浆细胞在骨髓内增殖和聚集，疾病晚期时也可见于外周血和其他软组织器官中[3]。恶性浆细胞会过度分泌κ，λ 轻链，以及单克隆免疫球蛋白（monoclonal protein），即M 蛋白。该病的临床表现主要由M 蛋白、游离轻链、恶性浆细胞或恶性浆细胞分泌的细胞因子引起，最终造成终末性的器官损害，如高钙血症（hypercalcemia）、肾功能不全（renal insufficiency）、贫血（anemia）以及骨病（bone disease），即典型的CRAB 征[4-5]。MM 的诊断标准就是根据轻链、M蛋白的水平、骨髓中克隆浆细胞的浸润以及新确认的生物标志物和CRAB 特性而制订的。用于MM的实验诊断的传统生物标志物虽有很多种，但MM的生存率仍然很低，因此，需要鉴定一些更敏感的生物标志物来提高MM 的早期诊断率。

2 骨髓微环境中的标志蛋白

2.1 骨髓间充质干细胞相关蛋白 骨髓微环境中骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal stem cells,BMSCs）在MM 进程中起着重要作用，研究显示，当骨髓瘤细胞与BMSCs 或骨祖细胞共培养时，吻素受体（KISSIR）的表达在这些细胞中均上调[6]，进而抑制成骨分化。从MM 患者骨髓液中分离得到的BMSCs 进行体外培养，观察到BMSCs 分泌的白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、生长分化因子15 和转化生长因子-β 等骨髓恶性浆细胞增殖有关因子水平升高，而且还观察到MM 患者的BMSCs 中分泌型蛋白dickkopf-1，IL-3 和IL-7 等抑制成骨分化相关的因子表达水平比健康对照组高[7]。此外，有研究表明，与健康对照组相比，MM 患者BMSCs 中产生的基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinases 1,MMP-1），MMP-2 和趋化因子CXCL13 等的表达显著增加，促进骨髓瘤细胞的侵袭和转移[8-9]。BMSCs 中这些差异表达的因子促进了MM 及其骨病的进展，这些新的生物标志物有可能用作早期敏感的MM 或骨髓瘤骨病的实验诊断指标及治疗靶点。

2.2 骨髓细胞外基质蛋白 细胞外基质（extracellular matrix,ECM）由胶原、纤维蛋白原、蛋白多糖和其他参与细胞黏附、迁移和分化的蛋白质组成。骨髓ECM 与细胞间的相互作用在骨髓瘤细胞归巢和增殖分化中起重要作用。有研究观察到，MGUS 及MM 患者骨髓ECM 中双糖链蛋白多糖Biglycan，纤溶酶原激活物抑制因子1、骨膜素表达水平增多，纤连蛋白fibulin-2，蛋白赖氨酸6-氧化酶及几丁质酶3 样蛋白1 表达减少，这些差异性表达的ECM 蛋白可促进MM 恶性浆细胞的黏附、侵袭、迁移及增殖[10]。骨髓成纤维细胞表面血小板源性生长因子受体β（platelet-derived growth factor receptorβ,PDGFR-β）也参与肿瘤细胞迁移，有研究报道，PDGFR-β 在MGUS 患者的骨髓成纤维细胞上表达上调，并且在MM 患者的相应细胞中表达水平进一步升高，而在正常者中PDGFR-β 的表达量极低，因此，PDGFR-β 可能作为MM 病程逐渐进展的标志蛋白。Versican 是一种ECM 硫酸软骨素蛋白聚糖，与多种癌症的发病机理有关，研究显示，MM 患者骨髓及血清中Versican 表达水平均明显升高，其水平与血清β2-微球蛋白（β2-microglobulin,β2-MG）和M 带呈正相关，而且血清中Versican 的ROC 曲线分析显示其具有较高的敏感度和特异度，表明Versican 也可能被用作MM潜在的实验诊断标志物[11]。

2.3 血管生成相关蛋白 肿瘤的生长都需要有效的血液供应，血管生成是MM 进展的一个持续特征。研究表明，从MGUS，SMM 到新诊断的MM 和复发性MM，骨髓血管生成程度逐渐增加，而且，骨髓微血管密度增加是MM 患者重要的诊断/预后因素[12]。研究显示，骨髓恶性浆细胞和内皮细胞分泌的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子等促血管生成因子水平增多，VEGF 的表达量与MM 病情的严重程度相关[13]。微血管内皮细胞和骨髓基质细胞会响应VEGF 刺激而分泌IL-6，IL-6 是骨髓瘤细胞的有效生长因子，反过来又促进骨髓瘤细胞分泌VEGF[14]。此外，血管生成素-2（angiopoietin-2,Ang-2）可通过增强VEGF 的作用来促进肿瘤血管生成，Ang-1 与之作用相反。有研究表明，与健康人比，新诊断或复发/难治性MM 患者血清Ang-1/Ang-2 比值下降[15]。另外，MM 患者的血清Ang-2 水平随着疾病严重程度的增加而增加，而且Ang-2 水平与血清β2-MG 水平及骨受累程度呈正相关，Ang-2 和VEGF 检测的敏感度和特异度也较高，表明Ang-2，VEGF 可与β2-MG 一起作为MM 诊断或预后的潜在标志物[16]。

3 非编码RNA

非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）包括微小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和环状RNA（circular RNA,circRNA），这些ncRNA 在MM 疾病进程中均起着重要作用。MM 患者外周血清的基因阵列分析发现三种表达差异较大的miRNA（miR-720，miR-1308 和miR-1246），这三种miRNA 对于区分健康对照、MGUS 及MM 患者的敏感度和特异度较高[17]。一些miRNA 还与许多常见的MM 实验室生物标志物显著相关。血清miR-214 和miR-135b 的表达水平可反映出骨病变的严重程度，能够区分有或不伴有骨病的MM 患者，可能成为替代影像学检查来鉴定MM 相关骨疾病的有力实验诊断指标。而且，血清miR-744，miR-130a，let-7d 和let-7e 水平与MM 患者的血红蛋白水平、血小板计数呈正相关，与肌酐、β2-MG 呈负相关，let-7e 的表达还与M 蛋白水平呈负相关，这些miRNA 可能成为MM 的早期敏感生物标志物[18-19]。

血清中异常表达的LncRNA 同样影响着MM的发生发展。研究显示，MM 患者血清中LncRNA MALAT-1，PDIA3P 表达上调，可抑制肿瘤细胞死亡或凋亡，促进肿瘤细胞增殖，而且PDIA3P还能增加肿瘤细胞的耐药性[20-21]。MM 患者血清IncRNA H19 也上调，临床病理学分析显示，IncRNA H19 的表达水平可以作为MM 临床分期的辅助标志物[22]。MM 的BMSCs 中lncRNA MEG3的表达水平降低，能够抑制BMSCs 成骨分化，促进MM 的骨质破坏[23]。这些lncRNA 表达水平的变化可估计疾病的严重程度，有助于MM 的早期诊断。

circRNA 在MM 中的研究较少，但也有研究表明circRNA 在骨髓瘤中的重要作用。研究发现，MM 肿瘤细胞中hsa_circ_0007841 及hsa_circ RNA_101237 明显上调，促进了MM 的溶骨性病变及肿瘤细胞耐药性[24-25]。circ0000190 在MM 骨髓组织和外周血中均表达下降，促进了骨髓瘤细胞增殖[26]。这些研究暗示了circRNA 具有作为MM 的新型实验诊断生物标志物和治疗靶标的潜力。

4 循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA

外周血中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）或循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）是特征性的肿瘤生物标记。CTCs 是从原发性或转移性肿瘤部位脱落进入到循环中的细胞，因此，它可准确反映疾病状况[27]。通过多参数流式细胞仪，可检测到从MM 患者骨髓进入到外周血的克隆性循环浆细胞，即骨髓瘤CTCs。研究表明，在新诊断的MM 患者中，400 个以上骨髓瘤CTCs的存在与较高的肿瘤增殖、不良的细胞遗传学、较低的总体生存率及较高的复发率相关[28]。另一项研究表明，超过100 个骨髓瘤CTCs 预示活动性MM复发患者的生存率较差[29]。此外，SMM 患者中高水平的CTCs 与其2～3年发展为MM 的风险增高相关[30]。研究还显示，MM 患者CTCs 携带的突变比例与骨髓克隆浆细胞的突变基本一致，外周血也许能用来确定MM 患者在疾病表现和进展过程中的突变情况[31]。这些数据表明CTCs 的实验室检测有助于MM 的早期诊断，并预测MM 患者的疾病状态和生存率。

ctDNA 是由肿瘤细胞的DNA 片段释放入循环系统的胞外DNA，全面反映了肿瘤细胞的遗传复杂性和异质性[32]。研究显示，MM 患者ctDNA 和骨髓样本的突变基因是一致的，ctDNA 对骨髓克隆突变和亚克隆突变的敏感度较高，分别为100%和96%[33]。研究还发现，高水平的ctDNA 与早期疾病复发相关，患者总体生存率明显较差，且ctDNA中TP53 突变比例比骨髓高，可能有助于MM 的早期诊断和预后[34]。与其他蛋白质标志物相比，ctDNA 的半衰期不到3 h，这表明它可以反映MM患者的实时肿瘤负担，也可以在常规蛋白质生物标志物和成像技术之前检测到肿瘤动力学的变化，比CTCs 和蛋白生物标志物更敏感和特异[32]。

5 展望

MM 的病理过程复杂，其早期实验诊断较困难，通过全面研究骨髓微环境中基因和蛋白质表达、外周血中ncRNAs，CTCs 以及ctDNA 等潜在生物标志物的动态变化，对在早期阶段识别和治疗MM 患者具有重要意义。此外，外周血中ncRNAs 的检测，以及在血液活检中对CTCs 和ctDNA 的检测，可以帮助临床医生在不进行侵入性骨髓检查的情况下评估疾病状态并早期诊断MM。这些新兴的生物标志物已展现出对MM 的诊断和预后潜力，但是上述生物标志物的标准化，仍需要不断地进行试验和验证之后，才能在未来的MM 临床检验中得到应用。