急性缺血性脑卒中患者血清miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p和miRNA146a水平表达检测的诊断价值研究

郭 洁，池水侠

(1.西安医学院第一附属医院急诊科，西安710077；2.咸阳市中心医院，陕西咸阳 712000)

急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)是临床上危害中老年人健康的心脑血管疾病，其具有高致死和致残率、高患病率和高复发率等特点[1-2]。AIS 主要是由于脑血液供应障碍，缺血、缺氧引起的局限性脑组织缺血性坏死或软化，进而出现相应的神经功能缺损表现。目前AIS 的诊断主要取决于查体、影像学检测和病史等，但是部分患者影像学表现不典型且费用昂贵、耗时较长。因此，探究miRNA 生物标志物用于AIS 的疾病诊断、病因识别和病情变化预测具有重要的临床意义[3]。本研究通过比较健康人群和AIS 患者血清miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 的水平，探究三者联合检测在AIS 诊断中的应用价值，旨在为AIS的临床诊断和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取西安医学院第一附属医院急诊科2019年5月～2020年3月收治的65 例AIS 患者为病例组，其中男性36 例、女性29 例；平均年龄51.7±4.2 岁。另选取同期于本院体检健康者50例为对照组，其中男性29 例、女性21 例；平均年龄53.8±3.4岁。本研究经我院伦理委员会审批通过，受试者自愿参加本研究且均签署知情同意书。两组的糖尿病史和高血压史等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。

纳入标准：AIS 患者均符合全国脑血管病学术会议修正的《各类脑血管疾病诊断要点》中AIS 相关的诊断标准[4]，并经MRI 检查或头颅CT 验证。

排除标准：①恶性肿瘤患者；②重要脏器功能异常者；③伴严重感染及免疫系统疾病者。

1.2 仪器与试剂 RT-PCR 仪购自德国Qiagen 公司，小型高速冷冻离心机购自德国Eppendorf 公司，RNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒和miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.3 方法 采集受试者空腹静脉血3 ml于试管中，5 000 r/min 离心5 min，将血清置于-20℃冰箱中保存。miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a的水平均采用实时灾光定量PCR(quantitative realtime PCR,qRT-PCR) 进行检测， 应用RNA 提取试剂盒提取血清中总RNA，应用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒将RNA 反转录为cDNA，采用RT-PCR 仪进行测定，反应条件是95℃ 5min；95℃ 30 s；58℃ 30 s 和72℃ 30 s，共40个循环。miRNA-181c-5p 上游引物序列为：5’-ACA CTCCAGCTGGGAACATTCAACCTGTCG-3’，下游引物序列为：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。miRNA-340-5p 上游引物序列为：5’-CTGGTAGGT TATAAAGCAATGA-3’，下游引物序列为：5’-TCAA CTGGTGTCGTGGAG-3’。miRNA146a 上游引物序列为：5’-CAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCATGGGT-3’，下游引物序列为：5’-GGGTGAGAACTGAATTCCA-3’。

采用美国国立卫生院卒中量表(NIH stroke scale,NIHSS)评价AIS 患者神经功能缺损程度[5]。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 统计学软件分析数据。计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验。相关性分析采用Pearson 相关，采用受试者工作特征曲线(ROC 曲线)计算miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 的AIS 诊断价值，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p和miRNA146a 水平的比较 见表1。比较两组血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a水平，结果显示相比于对照组，病例组血清miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 水平均升高，其差异均有统计学意义(均P=0.000)。

表1 两组血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 水平的比较

2.2 血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA 146a 水平与NIHSS 评分的相关性分析 Pearson 相关性分析结果显示，血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 水平与NIHSS 评分均呈显著正相关，其差异具有统计学意义(r=0.272，P＜0.001；r=0.142，P=0.005；r=0.171，P=0.013)。

2.3 miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a联合检测在AIS 中的诊断价值 miRNA-181c-5p 和miRNA-340-5p，miRNA146a 诊断AIS 的ROC 曲线见图1，根据ROC 曲线三者联合检测诊断AIS的灵敏度和特异度分别为71.2%和76.4%，高于miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a三项指标单独和两两联合检测，见表2。

图1 miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p，miRNA146a 诊断AIS 的ROC 曲线

表2 miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p，miRNA146a 联合检测在AIS 中的诊断价值

3 讨论

AIS 是脑卒中的常见类型之一，全球每年约有超过69 万人患AIS，随着人们生活质量的提高，我国AIS 的发病率明显增高。目前临床上仍未研发出针对AIS 的特效药物，因此，深入探究生物标志物对AIS 的诊断和治疗意义重大。miRNA 是广泛存在于真核细胞质中的长约18～25 nt 的内源性非编码单链小分子，大量研究指出miRNA 可作为AIS发生的“神经网络编码”，是疾病早期诊断、治疗和评估预后的新生物学标志物[6]。本研究通过比较两组血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 的表达水平，探究三者联合检测在AIS诊断中的应用价值。

近年来，有研究指出miRNA-181c-5p 可作为阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)的生物标志物，血清miRNA-181c-5p的缺失可能提示老年脑损伤[7]。miRNA-340-5p 在肺癌中呈高表达，是诊断肺癌较理想的指标[8]。miRNA-146a 是编码CD40L 的靶基因，而CD40L 是导致AIS 的影响因素[9-10]。本研究结果表明，病例组血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 水平均显著高于对照组，且与NIHSS 评分呈正相关，由此可证实 miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 可增加AIS 患病风险。ROC 曲线下面积结果显示，miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 对AIS 患者具有一定的诊断价值，当三者联合检测时灵敏度达71.2%，特异度达76.4%，提示miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 联合诊断具有更高的诊断率，为临床应用提供更加可靠的理论基础。

综上所述，miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 三者联合检测可进一步提高AIS 患者的诊断率，但关于其与AIS的预后仍需进一步深入研究。