中国西北地区102例儿童Duchenne型肌营养不良基因突变及家系分析研究

杨 乐，赵斯钰，郑妍妍，李桃利，宋西晓，王 燕

（西安市儿童医院神经内科，西安 710002）

Duchenne 型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是最常见的 X 连锁隐性遗传肌肉病，中国大陆发病率约为1/4 560[1]。该病多于3～5岁隐匿发病，进行性加重的肌萎缩及肌无力，临床表现为运动发育落后或运动障碍、Gower 征阳性、双下肢近端无力，走路缓慢，易跌跤，大多数的患儿存在腓肠肌假性肥大及心肌损害，少数有智力障碍。多于 20 岁前死于呼吸、循环衰竭[2]。目前DMD 缺乏有效的治疗措施，因此对DMD 基因突变的检测是控制和降低DMD 发病率的关键。本研究分析了就诊于西安市儿童医院的102 例DMD 患者基因特点，旨在了解西北地区DMD 患者基因谱，为DMD 的早期诊断及有效治疗措施提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 研究对象 收集2014年7月至2020年6月之间在本院神经内科门诊的102 例临床诊断为DMD患儿，父母否认近亲结婚，所有DMD 患者均来自西北地区，包括陕西、甘肃、青海、宁夏和新疆，就诊年龄1月～14 岁，平均年龄为4.60±3.59 岁。

入组标准：①多数婴幼儿时期运动发育较正常同龄儿落后；②隐匿起病，临床表现进行性加重，乏力，上楼困难，肌无力，下肢重于上肢，鸭步，Gower 征阳性，腓肠肌假性肥大；③血清肌酸激酶显著增高，高于正常数十到数百倍；④肌活检免疫组织化学染色提示抗肌萎缩蛋白缺失；⑤肌电图提示为肌源性损害；⑥排除其它神经肌肉系统疾病等。

1.2 仪器和试剂 主要仪器有扩增产物采用的遗传分析仪(ABI 3500 XL,MRC-Holland 公司)，主要试剂有SALSA MLPA P034 和P035 探针组（MRCHolland 公司)，高通量测序仪（Illumina）。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA 提取：经知情同意后抽取102例患儿及患儿母亲静脉血各3ml 装入EDTA-K2抗凝试管中，使用全血基因组DNA 提取试剂盒，进行基因组DNA 提取。

1.3.2 多重连接依赖探针扩增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）检测:MLPA技术是检测DMD 基因缺失/ 重复突变的主要方法[3-4]。利用SALSA MLPA P034 和P035 探针组进行DMD 基因79 个外显子拷贝数变异检测。数据采用Coffalyser 软件(MRC Holland)分析。结果判断标准：对应峰值在 0.7～1.3 提示拷贝数正常，0.3～0.7 提示杂合性缺失，1.3～1.7 提示杂合性重复，0 提示纯合缺失，1.7～2.3 提示重复突变[5]。

1.3.3 二代基因测序（next-generation sequencing，NGS）检测：可以检测DMD 基因点突变、微小缺失或插入突变等突变[6]，使用高通量测序仪测序。测序数据采用 Next Gene V2.3.4 软件与 UCSC hg19人类参考基因组序列进行比对和鉴别遗传变异，并收集目标区域的覆盖度和平均测序深度等质量参数。神经肌肉病相关基因测序目标区域平均测序深度为150X，其中目标序列的98%测序深度达20X以上。

1.3.4 Sanger 测序方法：用于验证DMD 患者和携带者中致病性点突变[7]。

1.3.5 根据患者基因突变类型选择相应的检测方法对其母亲及家系成员进行基因检测。

2 结果

2.1 DMD 基因一般情况 102 例DMD 患儿经MLPA 检测94 例患者存在DMD 基因致病性变异，包括片段缺失87 例（85.29%），片段重复7 例（6.86%）。MLPA 检测阴性的8 例（7.84%）患者进行NGS 检测，均为点突变。对所有患者母亲进行验证，74 例（72.55%）患儿母亲携带该基因突变，28 例（27.45%）为新发。14.9%的患者存在阳性家族史。

2.2 DMD 基因缺失/重复分析 见表1。87 例DMD 基因片段缺失中，19 例为单外显子缺失，45号外显子缺失最常见；18 例为3 个外显子缺失，最常见为48～50 区；29 例为大片段缺失（≥6 个外显子），其中央区存在一个缺失的热点区域，外显子44～54 区，且存在1 例79 个外显子全部缺失患者。

表1 87 例DMD 基因缺失区域

7 例DMD 基因片段重复中，3 例为外显子2重复，2 例为外显子16 重复，1 例为外显子44～60区域重复，1 例同时存在2 个重复区域，包括外显子44～47 区域与61～65 区域重复，2 号外显子为大片段重复突变的热点区域。见图1、图2。

图1 94 例DMD 基因缺失/重复频率

图2 94 例DMD 基因缺失/重复定位

2.3 DMD 基因点突变分析 见表2、表3。8 例DMD基因点突变，4例为无义突变，1例为插入突变，1 例为缺失突变，2 例为剪切突变，且其中3 例为新发突变，而且这8 例突变均为致病突变。

表2 DMD 基因8 例点突变一览表

表3 DMD 基因3 例新发突变

2.4 DMD 基因家系 见图3。本研究进行了2 个DMD家系的基因检测，家系1先证者为第Ⅲ代男性，DMD 基因为45～51 号外显子大片段缺失突变，第Ⅰ代男性DMD 基因为45 号外显子缺失，第Ⅱ代女性为携带，位于45～47 号外显子缺失，该家系突变位点为缺失突变的热点区域。家系2 先证者为第Ⅲ代男性，DMD 基因为17～18 号外显子重复，第Ⅰ代男性DMD 基因为17～18 号重复，第Ⅱ代2 位女性均为携带，分别位于2 号重复和17～18 号缺失，该家系突变主要以重复突变为主，且存在片段的重复和缺失。

图3 2 例先证者家系图

3 讨论

DMD 以缓慢进行性加重的对称性肌无力和肌萎缩为特征，主要累及骨骼肌，可伴智力障碍[8]和心肌损害，预后不良[9]。

DMD 基因是目前人类已知的最大的基因，有79 个外显子，全长约2.4Mb[10]。DMD 患者抗肌萎缩蛋白(dystrophin)表达缺陷导致细胞膜不稳定[11，4]，细胞内的肌酸激酶等外漏，肌细胞坏死，导致脂肪组织和纤维结缔组织增生。DMD 基因突变主要分为三种类型：外显子缺失或重复突变、点突变（包括碱基的置换、重复、缺失或插入）和剪切区突变[12]。

本研究收集西北地区DMD 患者102 例，72.5%为母系遗传，与既往研究比例相似。但需要注意的是：本研究中阳性家族史比例较高，考虑这些患者多居住在偏远或贫困地区，缺乏优生优育的相关知识，因此需加强对西北地区健康教育、遗传咨询工作，同时进行有效的产前诊断，以优化DMD 患者的出生，提高西北地区的人口质量。

文献报道，DMD 基因片段缺失为65%～70%，重复为6%～10%，两者共约 80%，而点突变约为20%[13]。本研究中片段缺失为85.29%，较相关研究比例多，而点突变比例少，是否和地域有相关性，有待样本数量扩增后进一步验证。在片段缺失的类型中， MAGRI 等[14]人研究发现DMD 基因的单外显子缺失占24%，YANG 等[15]人发现，中国人群中最普遍的单外显子缺失为45 和51，本研究单外显子缺失占21.84%，外显子45 是缺失最频繁的，与文献报道基本一致。

既往研究发现DMD 缺失突变集中在两个热点区域，最常见的为中心结构区，即外显子45～54 区域，第二个为5’端区域，即外显子3～22 区域。重复热点常涉及5’端区域[16]，即外显子2～22 区域和外显子2 区域[17]。本研究发现缺失与重复突变分别存在一个热点区域，外显子44 ～54 区域和外显子2区域，与既往研究略有偏差，可能与地域分布有关。本研究中的8 例点突变，50%为无义突变，且C>T是最常见的碱基替换，与钟京梓[18]报道的基本一致。

在DMD 家系报道中，陆盈等[19]报道了一例DMD 家系，先证者及单卵双生胞弟均为外显子45～50 区域缺失突变，考虑为新发突变所致。洪莎等[20]报道了2 例家系，家系1 属于框外突变，属于DMD 的可能性大，家系2 属于框内突变，属于BMD 的可能性大。本研究中2 个家系，第Ⅰ代男性临床症状轻，均为框内突变。第Ⅲ代男性为大片段缺失/重复突变，该突变破坏了阅读框的完整性，故临床症状较重。

基因检测已成为DMD 最新诊治指南中的新金标准[21]，故进行全面性基因检测，扩大西北地区DMD 疾病基因谱，可以为患者带来新的治疗希望。