深圳龙华区孕妇血清维生素D水平及其受体基因rs2228570多态性与子痫前期易感性相关性研究

崔普芳，刘爱胜，李 喆，张 燕，季新梅，刘国栋

（深圳市龙华区人民医院 a.妇产科；b.检验科，广东深圳 518109）

子痫前期（preeclampsia，PE）是妇女妊娠期内所特有的一种疾病，主要表现为妊娠20 周后出现高血压、蛋白尿及水肿，是导致孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一[1-3]。PE 发病病因和机制十分复杂，至今尚未完全阐明。有研究表明，孕妇维生素D（vitamin D，Vit D）缺乏会增加PE 和妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）的发病风险。Vit D 多种生物学效应主要通过与其受体（vitamin D receptor，VDR）结合才发挥的，但VDR 基因多个位点存在多态性，且其多态性可能会影响Vit D 水平表达或结构，从而导致VDR 基因多态性与多种疾病的发生和发展有关[4-6]。近年来，有关VDR 基因多态性与PE 易感性已见少数报道，但不同地区和种族人群之间结论不一致[7-9]。为此，本研究对深圳龙华区孕妇血清中VitD 水平及VDR 基因rs2228570 位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）进行了分析，为妊娠期PE 的早期诊断、治疗、预防及发病机制的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年3月～2020年12月在深圳市龙华区人民医院妇产中心就诊并确诊为PE的孕妇87 例为PE 组，其中轻度PE 48 例，重度PE 39 例。年龄23～49 岁，平均年龄32.56±8.91 岁。孕周20～29 周，平均25.02±3.18 周。选取同期健康孕妇120 例为对照组，年龄22～50 岁，平均年龄33.07±9.78 岁。孕周21～30 周，平均25.73±3.65 周。确保两组的年龄和孕周等一般性资料差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。纳入标准：①符合《妊娠期高血压疾病诊治指南（2015）》中PE 诊断标准[10]；②孕周≥20 周；③有规律产检和资料完整者；④单胎者；⑤自愿并积极配合者；⑥患者及家属知情同意者；⑦经同医院伦理委员同意批准。排除标准：①伴有实质器官、免疫及血液等基础疾病者；②伴有慢性高血压、心脏病、肝病、肾病及糖尿病者；③多胎者；④甲状腺功能异常者；⑤有免疫治疗史。

1.2 仪器与试剂 c8000 分析仪及试剂（购于美国雅培公司）；1,25-(OH)2Vit D3试剂盒（购于广州菲康生物技术有限公司）；DNA 提取试剂盒（购于深圳亚能生物技术有限公司）；ABI7500 PCR 基因扩增仪（购于美国ABI 公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：于清晨采集空腹静脉血5～7ml，其中2～3ml 于EDTA-K2抗凝管内，充分混匀，用于VDR 基因rs2228570 位点单核苷酸多态性分析，剩余的加入无抗凝剂的干燥管内，室温静置30min后，分离血清，用于1,25-(OH)2Vit D3水平检测。

1.3.2 1,25-(OH)2Vit D3水平检测 ：采用c8000 分析仪对1,25-(OH)2Vit D3水平进行检测。检测前对仪器进行保养、校正及质控检测。所有操作按仪器和试剂盒说明书进行，确保结果的准确性和可比性。

1.3.3 DNA 提取：采用DNA 提取试剂盒提取外周全血DNA，并运用核酸荧光蛋白定量仪对提取的DNA 浓度和纯度进行检测，将A260nm/A280nm 比值为1.7～1.9 的DNA 提取物置于-20℃冰箱中保存备用。

1.3.4 多态性分析： 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法对VDR 基因rs2228570 位点多态性进行分析，具体操作参照文献[7,9]。

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以百分率（%）表示，两组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组1，25-（OH）2Vit D3水平比较 PE 组血清中1，25-（OH）2Vit D3水平（21.67±5.86 nmol/L）明显低于对照组（37.29±7.65 nmol/L），两组间差异有统计学意义（t=4.082 5，P=0.032 7）。

2.2 不同程度PE 孕妇1，25-（OH）2Vit D3水平比较重度PE 孕妇1，25-（OH）2Vit D3水平（15.87±3.24 nmol/L）明显低于轻度PE孕妇（26.95±6.43 nmol/L），两者差异有统计学意义（t=3.5127，P=0.0352）。经Spearman 相关性分析，PE 组1，25-（OH）2Vit D3水平与PE 病情严重程度呈负相关（r= -0.612 4，P=0.05）。

2.3 两组VDR 基因rs2228570 位点基因型及等位基因频率比较 见表1。两组孕妇VDR 基因rs2228570 位点多态性均检出TT，CT 和CC 三种基因型，经χ2检验，两组孕妇VDR 基因rs2228570位点基因型和等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（χ2= 1.0893 ，0.851 6；P=0.079 1，0.115 4），具有样本代表性。PE 组VDR基因rs2228570 位点CC 基因型及C 等位基因频率明显高于对照组（65.52% vs 29.17%，77.59% vs 42.50%），两组间差异有统计学意义（χ2=7.280 3，5.102 8，均P<0.05）。CC 基因型和C 等位基因孕妇患PE 的相对风险增加（OR=1.928，95%CI：1.503～2.617 和OR=1.643，95%CI：1.204～1.921），而TT 基因型和T 等位基因孕妇患PE 的相对风险降低（OR=0.529，95%CI：0.326～0.793 和OR=0.671，95%CI：0.485～0.916）。

表1 两组VDR 基因及不同程度PE VDR 基因rs2228570 位点基因型及等位基因频率（%）比较

2.4 不同程度PE VDR 基因rs2228570 位点基因型及等位基因频率比较 见表1。重度PE 组 CC 基因型及C 等位基因频率高于轻度PE，两者间差异有统计学意义（χ2=2.594 3，2.976 0，均P<0.05）。

2.5 PE 组不同基因型1，25-（OH）2Vit D3水平比较 PE 组CC 基因型1，25-（OH）2Vit D3水平（13.78±2.91 nmol/L）明显低于CT 和CC 基因型孕妇（23.84±6.37 nmol/L 和25.06±6.72 nmol/L），差异有统计学意义（t=3.920 4，4.271 5，P=0.029 6，0.021 7），但CT 和TT 基因型之间差异无统计学意义（t=0.970 3，P=0.152 8）。

3 讨论

PE是妇女妊娠期特有的一种常见严重并发症，其发病率约为2%～8%，且呈逐年上升趋势。目前，PE 仍缺乏有效的诊断和治疗手段，及早终止妊娠是唯一解决办法。若诊断和治疗不及时，进一步发展为子痫，孕产妇可能因出现溶血，肝酶升高和血小板减少（hemolysis,elevated liver enzymes,and low platelet count，HELLP）综合征、胎盘早剥、急性肾衰竭及肺水肿等严重并发症而死亡，而胎儿轻者可出现生长受限及神经受损，严重者会导致死亡，严重影响孕妇和胎儿的身心健康和生活质量[11-12]。但PE 病因和发病机制至今尚未明确，给临床诊断和治疗带来很大挑战。因此，探索PE 病因及发病机制对PE 的诊断、治疗及预防具有重要的意义。

Vit D 是一种固醇类衍生物，主要参与体内钙磷代谢，但最近研究发现，Vit D 与糖脂代谢、免疫应答及炎症反应的调节有关，其含量高低与高血压、糖尿病及高脂血症等多种代谢性疾病有密切关系。Vit D 与VDR 结合后可参与胚胎着床、妊娠相关蛋白（pregnancy-associated protein，PAPP）和细胞因子的分泌及钙的输送，在维持正常妊娠和胎儿生长发育中发挥着重要作用[13-14]。有研究表明，约有40%～62%的妊娠期妇女Vit D 水平降低或缺乏，而VitD 水平降低或缺乏可增加PE 的发病风险[15]。1，25-（OH）2Vit D3是体内Vit D 主要存在形式，其水平高低直接反映Vit D 水平。本研究结果显示，PE 组1，25-（OH）2Vit D3水平明显低于对照组，且重度PE 比轻度PE 降低更为明显（P<0.05）。经Spearman 相关性分析，1，25-（OH）2Vit D3水平与PE 病情严重程度呈负相关（r=-0.612 4，P<0.05），与徐晓锋等[16]报道的基本一致，这表明Vit D 在PE 的发生和进程中发挥了重要的作用，这可能与Vit D 水平降低对肾素分泌的抑制作用减弱，导致肾素分泌增加，从而促进血管平滑肌细胞增殖有关[15,17]。

PE 发病和发展过程十分复杂，与遗传、氧化应激、免疫失衡、炎症反应、胎盘异常及缺血等多种因素有关，但具体病因及发病机制尚未完全阐明。但有研究表明，PE 发病是由遗传和环境因素共同作用所导致的，其中遗传因素在PE 的发生和发展中发挥了重要的作用[7,9]。VDR 基因位于12号染色体长臂1 区3 带处，存在多个SNP 位点，极易发生基因多态性突变，从而影响VitD 水平或导致其结构异常，与多种疾病的发生和发展有密切关系[6,18-19]。有研究表明，VDR 基因rs2228570位点多态性与妊娠期PE 发病有一定相关性[7,9]，而REZENDE 等[8]报道两者之间无相关性，这说明VDR 基因rs2228570 位点多态性与妊娠期PE 发病的相关性存在地区和种族性差异。本研究结果显示，PE 组和对照组VDR 基因rs2228570 位点基因型和等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，表明本研究所选取的样本具有良好的群体代表性。PE 组VDR 基因rs2228570 位点CC 基因型和C 等位基因频数比对照组明显升高，且重症PE明显高于轻症PE（P<0.05），同时携带CC 基因型和C 等位基因孕妇患PE 的相对风险明显增加，与有关报道[7,9]的结论基本一致，这表明VDR 基因rs2228570 位点多态性可能与深圳地区妊娠期PE 发病有一定关系，其中CC 基因型可能是该地区妊娠期PE 发病的易感基因之一，这可能与VDR 基因突变后与Vit D结合增加胎盘和子宫内血管壁的炎症，从而导致孕妇患PE 的相对风险增加有关[20]。此外，结果还显示，携带CC 基因型孕妇血清中1，25-（OH）2Vit D3水平降低比CT 和TT 基因型更为明显（P<0.05），这说明VDR 基因多态性突变可能是通过影响1，25-（OH）2Vit D3水平或导致其结构异常而在妊娠期PE 发病中发挥重要作用的[21]，具体作用机制有待深入研究。

综上所述，深圳地区妊娠期PE 孕妇血清中1，25-（OH）2Vit D3水平明显降低，且VDR 基因rs2228570 位点多态性与妊娠期PE 发病有一定相关性，但存在地区和种族性差异。因此，加强不同地区人群Vit D 水平及VDR 基因多态性监测分析，对妊娠期PE 孕妇的早期诊断、治疗及预防具有重要的意义。