ATP生物荧光技术在肉品生产在线清洁度监测中的可行性研究

黄 炎，张文平，凌艳明

（1.明尼苏达矿业制造医用器材（上海）有限公司，上海200233；2.山东新希望六和集团有限公司，山东 青岛266102；3.潍坊和盛园食品有限公司，山东 潍坊262127）

ATP（三磷酸腺苷）是一种化学物质，存在于所有活生物体的细胞中，含1分子腺嘌呤、1分子核糖和3个相连的磷酸基团构成的高能磷酸化合物。McElroy W D[1]最早实现了化学能向光能的转化。细胞受损或死亡时，其ATP值迅速下降或消失，因此ATP浓度和活细胞数密切相关[2]。可以通过化学反应[1]来检测细胞内源性ATP含量，反应活细胞数量：

ATP+D-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+PPi+O2+Light

目前，多数的文献围绕医疗器械清洗效果展开[3-5]，表明ATP可作为快速检验可重复医疗器械清洗效果和医务人员手卫生质量的评价。ATP检测技术在食品工业的多个领域也有采用，如脱水蔬菜和调味品的含菌量测定[6]、农副产品辐照灭菌效果测定[7]、啤酒中菌落总数的快速测定[8]、肉制品新鲜度快速测定[9]等。

食品加工过程需要对清洗效果进行判读，主要有感官判断、微生物培养和ATP生物荧光检测。但利用涂抹工具与平板培养法共用的方法来检测表面的微生物不能满足食品生产环境实时监测（HACCP）管理要求。ATP生物荧光检测方法较琼脂培养法具有灵敏度高、无需大量人员、无需额外的准备、收尾工作及操作简便、需要时间短等特点[10]。国内外已有部分文献论述ATP生物荧光检测法与琼脂平板计数法存在相关性，但对于肉品加工环境的应用效果和经济效益并无论述，试验采用ATP生物荧光检测法与琼脂平板计数法对肉品加工环境下的人员手部清洁度和设备实施清洁度的情况进行对比评估，预期两者存在一定的相关性，为肉品行业在线实时监控提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验仪器

3MTMClean TraceTM荧光检测仪（LM1）、3MTMClean TraceTM表面ATP涂抹棒（UXL 100）、无菌棉拭纸棒、一次性无菌培养皿、刻度吸管、刻度试管、高温高压灭菌锅、培养箱、菌落计数培养基。

1.2 取样点

某车间生产环境位点7个及员工手部。

1.3 现场采样方法

1.3.1 ATP生物荧光检测的采样方法

取出冷藏于冰箱内的包装袋在室温下放置10 min后，从3MTMClean TraceTM表面ATP涂抹棒中取出采样棒，对位点进行充分涂抹。

1.3.2 ATP生物荧光检测的检测方法

涂抹后，采样棒插入装置，用力向下推压蓝色手柄使采样棒充分插入，并迅速振荡涂抹棒5 s以激活和混合反应体系。打开3MTMClean TraceTM荧光检测仪样品盖，将激活后的涂抹棒插入装置中，点击仪器屏幕上的检测按钮，开始检测，10 s后判读RLU结果。

1.3.3 微生物涂抹的采样方法

用浸有无菌生理盐水的棉拭纸棒对同一位点进行充分涂抹后，将接触部分折断，剩余棉拭纸棒放入盛有9 mL无菌生理盐水的试管中，带回实验室进行稀释、培养与计数。

1.3.4 微生物涂抹的检测方法

将试管振荡后，吸取1 mL原液加入盛有9 mL的无菌生理盐水试管中，稀释成1∶10的稀释液，再吸取1∶10稀释液加入到9 mL无菌生理盐水的试管中，混匀成1∶100的稀释液。在上述稀释度中各取1 mL加入到无菌培养皿中，然后倾注15~20 mL无菌菌落计数培养基到无菌平皿中，并旋转平皿，使菌悬液和琼脂进行充分混匀。待琼脂冷却凝固后，倒置平皿，底部朝上，置于36℃恒温培养箱中培养48 h后，进行菌落总数计数。

1.3.5 微生物计数方法

培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。按照GB 4789.2中的相关规定进行判读、计算和结果报告。

1.4 数据统计分析

试验数据采用Excel建立数据库，运行SPSS统计软件对数据进行统计分析。分别分析RLU的对数值和菌落总数对数值进行统计学线性相关分析和线性回归分析。

2 结果与分析

2.1 洗手后菌落总数和荧光值检测结果

员工洗手后ATP生物荧光法和琼脂法的检测结果见表1。

表1 员工洗手后ATP生物荧光法和琼脂法的检测结果

由表1可知，RLU值和菌落总数结果呈一定的线性关系。以RLU值的对数值为X轴，菌落总数的对数值为Y轴，作散点图（图1），作统计学线性分析得出回归方程Y=1.286 4X-3.024 4，R2=0.930 8，p<0.001，具有统计学意义。也就是说，两者具有线性回归关系，说明对于员工手部清洗效果用RLU值可以预测菌落总数结果，及时反馈手部清洗消毒后效果。

手部清洗后RLU对数值与菌落总数对数值的线性关系见图1。

图1 手部清洗后RLU对数值与菌落总数对数值的线性关系

2.2 设备表面菌落总数和荧光值检测结果

设备表面一共采集了105个样本，其中73个样本在结果判定中完全一致（2种方法同时小于限值或同时大于限值的检样数），23个样本ATP涂抹结果超标而微生物涂抹合格，5个样本微生物涂抹超标而ATP涂抹结果合格。清洗消毒后，将微生物结果有意义的39个环境表面涂抹的结果（ATP荧光值和微生物结果）进行对数值转换，以RLU值的对数值为X轴，菌落总数的对数值为Y轴，作散点图（图2），作统计学线性分析得出回归方程Y=0.337 4X+0.905 4，p<0.001，具有统计学意义。也就是说，两者具有线性正相关关系，说明荧光值越高，微生物的风险越高。

设备清洗后RLU对数值与菌落总数对数值的线性关系见图2。

图2 设备清洗后RLU对数值与菌落总数对数值的线性关系

2.3 ATP在车间环境应用的可行性结果

假设传统方法检测一个样品的材料费为3元，ATP检测一个样品的材料费为18元。传统方法需要2个人工进行操作，人工成本为3 000元/月；而ATP方法需要现场质量操作工随时操作，免去额外的人工成本。对于传统方法还需要制备培养基所需的洗刷灭菌等操作带来的水电费用，为300元/月。ATP检测仪的折旧费定为2 000元/年。假设单个工厂每个月需要涂抹N个样品，则传统方法一年需要的检测费用为39 600+36 N。而ATP涂抹方法一年需要的检测费用为2 000+216 N。当N<208个样品时，使用ATP涂抹的成本会比传统涂抹方法的成本更低。

3 结论

3.1 ATP生物荧光检测法对手部清洗效果的评价

由图1可知，RLU值和菌落总数值之间具有一定的正相关性，p<0.001，说明具有统计学意义。RLU值表征的是清洗效果，清洗质量是消毒成功的前提，大量的文献表明，消毒前对设备进行有效清洗，可以使细菌数量和有机物明显降低，否则会造成灭菌过程失败[11-12]。在医疗卫生行业，有较多的文献表明ATP荧光检测方法和细菌培养法对手卫生消毒效果结果一致，且ATP生物荧光方法可以在现场直观、快速得出结果，对医务人员教育意义较大，提高医务人员参与感控的积极性[5，13-14]。同样，在食品加工环节中，人是影响食品质量的一个重要因素，利用ATP荧光检测方法可以在现场实时得出结果，提高企业所有员工参与质量提升的主动性。

3.2 ATP生物荧光检测法对加工设施清洁度的评价

由图2可知，RLU值和菌落总数之间具有一定的正相关性，p<0.001，具有统计学意义。食品生产设施表面对食品生产的质量起到非常重要的作用，特别是食品直接接触面。刘阳等人[15]研究表明，ATP生物荧光检测计数测定的荧光值和物体表面的菌落总数情况存在良好的相关性，且ATP值不合格的点，其对应的平板计数的结果也会不合格。在试验中，2种方法分别判定是否合格的一致率达到78.23%。另外，检测点ATP值高，其24 h后必然大量滋生细菌而导致严重污染。目前，ATP生物荧光检测方法虽然应用于食品行业多年，但未有报道关于其在食品行业中的详细评价结果。但从ATP生物荧光检测方法在医疗器械清洗效果的评估中，可以看到ATP生物荧光检测方法可以快速评估清洗效果，且利于提高清洗质量[3-4]。

3.3 引入ATP生物荧光检测法对运营成本的影响

有文献指出，ATP生物荧光检测技术存在一定的局限性，如耗材为一次性且价格昂贵，食品企业负担不起[10]。如果单纯从耗材角度看，ATP生物荧光检测方法的价格的确会比平板检测贵，但综合样品制备、人员配置、检测时间等因素考虑，在一定检测量下，ATP生物荧光检测方法可以带来的经济效益较平板培养法更大。

食品工业中的ATP生物荧光检测的内容包括微生物和食品残渣[16]。清洗是食品加工过程中的核心步骤，保证清洗效果可以进一步确保消毒效果。ATP来源于活细胞，活细胞不仅存在于微生物中也存在于食品残渣中，食品残渣更是微生物滋生的重要来源。因此，将ATP生物荧光检测方法和微生物培养皿方法一起使用，ATP生物荧光检测法确定清洗效果，而微生物培养皿方法确定消毒效果及微生物污染的种类和来源。ATP生物荧光检测方法是一种主动控制污染事故发生的有效方法[17]，其优点在于根据检查结果，符合HACCP监测要求，现场确认污染情况并数值化，对于生产环节的现场处理提供了可靠的依据，提出具有说服力的指导。利用软件系统可以追踪位点监测结果变化趋势，防患于未来。有文献报道，次氯酸盐、季铵盐、含量1 000 mg/L过氧化氢等对ATP生物荧光法RLU值测定并没有显著性影响[18]；但也有文献报道，乳酸、1 000 mg/L过氧化氢可降低RLU检测值[19]。因此，加工环境中的消毒剂残留对清洁度快速检测是否有影响，需要进一步的研究。