产γ-聚谷氨酸菌株的筛选与培养基优化

车顺松，安 蕊，冉光雨，乔宗伟，邱俊杰，吴 杰，杨雷军，毕长富，王风青

（四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾644005）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是一种由微生物生产的细胞外高分子氨基酸聚合物，由L-谷氨酸（L-Glu）、D-谷氨酸（D-Glu）单体通过酰胺键连接而成[1]。它具有成膜性[2]、可食用性[3]、生物相容性[4]、水溶性[5]、生物可降解性[6]和无毒[7]等特性，广泛用于食品[8]、化妆品[9]、生物医药[10]、农业[11]、环境[12]等领域。

γ-PGA作为食品增稠剂、稳定剂，加入带鱼鱼糜可显著提高带鱼鱼糜的凝胶强度，且对鱼糜的白度值影响较小[13]；加入到冰激凌中可以改善油脂固体颗粒的分散度，减少冰晶形成，提高混料黏度，改善口感，提高膨胀率和融化率[14]；分子量低于200 kDa的γ-PGA具有极好的抗冻性，其抗冻活性明显高于目前公认的具有高抗冻活性的葡萄糖，对需要反复冻融或者对冷冻敏感的食品有很好的保护作用[15]。γ-PGA水凝胶处理可以抑制香菇贮藏过程中的褐变，抑制PPO活性，延缓维C的降解，控制香菇的失重，保持菇体的含水量，使香菇保持良好的保鲜品质，并延长香菇的贮藏期[16]。γ-聚谷氨酸添加于面包中，可以提高面包在贮藏期中的品质，抑制面包的老化，延长面包的贮藏期[17]。

通过高产γ-PGA菌株的筛选，并对发酵条件经行一系列优化以实现高产γ-PGA。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

酸菜水（四川、东北、湖北），黄浆水（湖北、东北），黄水（四川），传统大豆发酵食品（四川、湖北）等。

1.1.2 试剂

CTAB，上海麦克林生化科技有限公司提供；谷氨酸钠，成都市克隆化学药品有限公司提供；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基及培养条件

（1）固体培养基（LB培养基）。酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，谷氨酸钠10 g/L，琼脂20 g/L，pH值7.4~7.6。用于产γ-PGA菌种的分离纯化，37℃下培养24 h。

（2）斜面培养基。蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂20 g/L。用于菌种保藏，37℃下培养24 h。

（3）种子培养基。蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉3 g/L，葡萄糖20 g/L，氯化钠5 g/L。种子培养：装液量50/250 mL，温度37℃，转速150 r/min，摇床培养18 h。

（4）基础发酵培养基。谷氨酸钠40 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，氯化钠10 g/L。接种量2%（V/V），装液量50/250 mL，温度37℃，转速150 r/min，摇床培养48 h。

1.2 仪器与设备

THZ-A型气浴恒温振荡器、DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海助蓝仪器科技有限公司产品；PHS-25型台式酸度计，上海雷磁公司产品；YXQ-75SII型立式压力蒸汽灭菌器、YXQ-LS-18SI型手提式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；752N型紫外可见分光光度计，上海诺科仪器仪表有限公司产品；FA2004N型精密电子天平，杭州万特衡器有限公司产品；R1-TGC-N50型高速离心机，无锡市瑞江分析仪器有限公司产品；H10-50133型生化培养箱，天津宏诺仪器有限公司产品；ZWY-2102型摇床培养箱，太仓市华利达实验设备有限公司产品。

2 试验方法

2.1 菌种筛选

2.1.1 初筛

分别取少量传统大豆发酵食品、黄水、黄浆水、酸菜水，在无菌操作台中用无菌生理盐水稀释，吸取0.1 mL涂布于LB平板，于37℃下恒温培养24 h，挑选出形态大、表面光滑、高黏湿润的单菌落，将挑选出来的单菌落再次在固体分离培养基上进行三区划线，于37℃下恒温培养24 h，挑选出具有相同特点的单菌落，并且接种到斜面上。

2.1.2 复筛

取斜面保藏的初筛菌种，转接入50 mL/250 mL装液量的种子培养液，在温度37℃，转速150 r/min条件下，摇床振荡培养10 h，然后按2%的接种量转接到50 mL/250 mL装液量的酵培养基中，在温度37℃，转速150 r/min条件下，振荡培养48 h，发酵结束后测定γ-PGA的产量。

2.1.3 生长曲线测定

选取复筛菌株中γ-PGA产量最高的菌株接种至50 mL/250 mL装液量的种子培养液，于37℃下以转速150 r/min恒温振荡培养24 h。按2%接种量接种至50 mL/250 mL装液量的种子培养液，37℃下以转速150 r/min恒温振荡培养24 h，每隔2 h取样，于波长600 nm处测定其吸光度，记录数据并绘制其生长曲线。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌落及菌体形态特征鉴定

（1）菌落形态特征。观察菌株在LB平板上37℃下恒温培养24 h的菌落形态特征。

（2）菌体形态特征。取平板上培养了24 h的菌种进行革兰氏染色，将制备好的样片置于显微镜下观察，拍照记录。

2.2.2 生理生化管鉴定

在无菌操作台中，用接种环从斜面培养基上分别挑取适量菌体于蔗糖、半乳糖、七叶苷、乳糖等21种生化管中，再用灭菌后的棉花团塞住，培养24 h后对比其与初始管的颜色变化，从而鉴别细菌的菌属。

2.2.3 细菌16S DNA鉴定

将复筛中γ-PGA产量最高的菌株送至苏州金唯智生物科技有限公司进行16S DNA测序。

2.2.4 CTAB比浊法测定聚谷氨酸

γ-PGA可与十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的氢氧化钠溶液反应形成混悬液，CTAB溶液质量浓度为2 g/L，反应温度为环境温度，络合时间为3 min，于波长250 nm处测定其吸光度[18]。

（1）CTAB-NaOH溶液的配置。准确称取5 g NaOH于烧杯中，加入少量纯净水完全溶解后转入100 mL容量瓶中，用纯净水定容至100 mL，再准确称取0.2 g CTAB于NaOH溶液中，待药品完全溶解后，装入小药瓶中低温干燥环境下放置备用。

（2）γ-PGA标准曲线的测定。准确称取0.010 0 g γ-PGA标准品，用蒸馏水或去离子水定容至50 mL，配置成200 μg/mL的γ-PGA母液，用母液稀释配置成5，10，15，20，25，30，35，40 μg/mL的γ-PGA溶液，分别与2 g/L的CTAB溶液（用5%的NaOH溶液配制）1∶1混合，反应3 min左右，于波长250 nm处测定其吸光度，以γ-PGA质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

（3）γ-PGA粗品测定。将发酵液稀释后，取2 mL稀释的发酵液加入2 mL离心管中，以转速12 000 r/min离心3 min后取出，加入等体积十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的氢氧化钠溶液反应形成混悬液，络合3 min左右于波长250 nm处测定吸光度，并带入标准曲线得出实际产量。

2.3 γ-PGA液体发酵培养基的优化

2.3.1 氮源种类及浓度对γ-PGA产量的影响

在基础发酵培养基中分别加入5 g/L的蛋白胨、大豆分离蛋白、胰蛋白酶胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、硫酸铵、氯化铵、柠檬酸三铵、尿素为氮源，其他成分与基础发酵培养基一致，50 mL/250 mL装液量，2%接种量，37℃下以转速150 r/min摇床培养48 h后测定发酵液中γ-PGA的含量，确定最优氮源种类。最优种类氮源进行3，4，5，6，7，8 g/L的梯度培养，确定最佳氮源质量浓度。

2.3.2 碳源的种类及质量浓度对γ-PGA产量的影响

在基础发酵培养基中分别加入50 g/L的葡萄糖、糊精、玉米糖化液、蔗糖、尿素、柠檬酸三铵为碳源，氮源以优化后为准，其他成分与基础发酵培养基一致，50 mL/250 mL装液量，2%接种量，37℃下以转速150 r/min摇床培养48 h后测定发酵液中γ-PGA的含量，确定最优碳源，最优碳源进行30，40，50，60，70，80 g/L梯度培养，确定最佳碳源质量浓度。

2.3.3 前提物谷氨酸钠质量浓度对γ-PGA产量的影响

在基础培养基中分别加入20，30，40，50，60，70 g/L的谷氨酸钠，碳源、氮源以优化后的为准，其他成分与基础发酵培养基一致，培养方法同上，测定其最佳质量浓度。

2.3.4 氯化钠质量浓度对γ-PGA产量的影响

在基础培养基中分别加入6，8，10，12，14，16 g/L的氯化钠，碳源、氮源、前提物以优化后为准，培养方法同上，测定其最佳质量浓度。

2.3.5 金属离子的种类及质量浓度对γ-PGA产量的影响

在优化后的培养基中分别梯度添加如下3种金属离子：

（1）硫酸镁（W/V）。0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%；

（2）磷酸氢二钾。0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%；

（3）硫酸锰。0.002%，0.004%，0.006%，0.008%，0.010%，0.012%。

50 mL/250 mL装液量，2%接种量，150 r/min摇床，于37℃下培养48 h后测定发酵液γ-PGA含量，确定最优金属离子种类及质量浓度。

2.3.6 最佳发酵时间的确定

在优化后的培养基的基础上，50 mL/250mL装液量，分别接入2%的种子液，转速150 r/min，37℃下培养，分别培养24，48，72，96 h，测定γ-PGA含量，确定最佳发酵时间。

3 结果与分析

3.1 γ-PGA生产菌的筛选与鉴定

3.1.1 γ-PGA的生产菌筛选

从传统大豆发酵食品、黄水、黄浆水、酸菜水等多种材料中，经过平板初筛得到8株菌落直径大而湿润、黏稠的菌株。初筛菌株发酵48 h，测γ-PGA的产量，γ-PGA产量最高得菌株即为目标菌株。

菌株筛选见图1。

图1 菌株筛选

3.1.2 菌株Y8的鉴定

（1）菌株Y8的菌落和菌体形态特征。对菌株Y8的菌落形态、革兰氏染色、芽孢染色等特征进行了观察。该菌株在LB平板上培养24 h后，菌落呈无色到乳白色、半透明、圆形、突起、边缘齐整，直径4~5 mm，表面光滑、黏稠、能拉丝。显微镜观察后，其菌体个体较大，直杆状，大小一般在1.7~2.1×0.5~0.8 μm，革兰氏染色阳性，有芽孢。

3.1.3 生理生化管鉴定结果

对YB18菌株菌种进行细胞形态观察及生理生化特征试验，该菌株细胞形态为杆状、革兰氏染色阳性，可形成芽孢、孢囊不膨大，接触酶阳性、氧化酶阳性，能够利用α-D-葡萄糖、明胶、D-麦芽糖、D-果糖-6-磷酸、D-海藻糖、D-半乳糖醛酸、半乳糖酸内酯、葡萄糖醛酰胺、β-甲基-D-葡糖苷、N-乙酰-D-葡糖胺、蔗糖、龙胆二糖、甘油、肌醇、D-甘露醇、D-山梨醇、松三糖、D-甘露糖、D-果糖、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、果胶、D-葡糖酸、粘酸、糖质酸、L-乳酸、柠檬酸、L-苹果酸、糊精、甲酸生长，不能利用D-葡萄糖-6-磷酸、D-纤维二糖、D-葡萄糖醛酸、甘氨酸-L-脯氨酸、β-羟基-D,L-丁酸、D-半乳糖、肌苷、L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-岩藻糖、D-水杨苷、水苏糖、D-棉子糖、α-D-乳糖、D-蜜二糖、乙酸、丙酸、乙酰乙酸、α-丁酮酸、α-羟丁酸、γ-氨基丁酸生长，对萘啶酸、万古霉素、林可霉素、1%乳酸钠、醋竹桃霉素、十四烷硫酸钠敏感。

生理管鉴定结果见表1。

表1 生理管鉴定结果

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版对芽孢杆菌的阐述结合对该菌株的观察，确定该菌为芽孢杆菌属。

3.1.4 分子生物学鉴定

菌株16S rDNA测序及比对结果如下：

所测菌株与数据库里对比相似度最高的是：Bacillus subtilis。将此菌株命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisYB18。

3.2 培养优化

3.2.1 γ-PGA生产菌生长曲线的测定

选取复筛菌株中γ-PGA产量最高的菌株接种至50 mL/250 mL装液量的种子培养液，于37℃下以转速150 r/min恒温振荡培养24 h。按2%接种量接种至50 mL/250 mL装液量的种子培养液，于37℃下以转速150 r/min恒温振荡培养24 h，每隔2 h取样，于波长600 nm处测定其吸光度，记录数据并绘制其生长曲线。

由图2可知，在0~14 h，菌体数量主要呈上升趋势，10 h后进入生长对数期，12 h后逐渐进入稳定期，14 h时达到最大值，之后进入衰亡期，结果表明种子液的培养时间为10 h。

γ-PGA生产菌的生长曲线见图2。

图2 γ-PGA生产菌的生长曲线

3.2.2 氮源种类及质量浓度对γ-PGA产量的影响

培养基不同种类氮源质量浓度均为5 g/L，其他成分及质量浓度与基础发酵培养基相同。接种量2%，装液量50 mL/250 mL，于37℃下以转速150 r/min恒温振荡培养48 h，测定不同物质作为氮源时发酵液中γ-PGA的含量。

氮源种类对γ-PGA产量的影响见图3。

图3 氮源种类对γ-PGA产量的影响

由图3可知，牛肉浸粉作为氮源的发酵液中γ-PGA产量最高，由此可见牛肉浸粉为最优氮源。

基础发酵培养基加入牛肉浸粉作为氮源，设置牛肉浸粉质量浓度梯度，其他条件同上，培养48 h，测定γ-PGA产量，得牛肉浸粉质量浓度与γ-PGA产量关系图。

牛肉浸粉质量浓度对γ-PGA产量的影响见图4。

图4 牛肉浸粉质量浓度对γ-PGA产量的影响

γ-PGA产量在牛肉浸粉质量浓度为11g/L时出现最大值4.05 g/L，之后产量下降，由此可得牛肉浸粉最优质量浓度为11 g/L。

3.2.3 碳源种类及质量浓度对γ-PGA产量的影响

在基础发酵培养基中分别加入50g/L的葡萄糖、糊精、玉米糖化液、蔗糖、尿素、柠檬酸三铵为碳源，氮源以优化后为准，其他成分与基础发酵培养基一致，50 mL/250 mL装液量，2%接种量，37℃下以转速150 r/min摇床培养48 h后测定发酵液中γ-PGA的含量，确定最优碳源。

碳源种类对γ-PGA产量的影响见图5。

由图5可知，其中玉米糖化液作为碳源时γ-PGA产量最大，最大产量为1.02 g/L，由此可得最优碳源为玉米糖化液。

图5 碳源种类对γ-PGA产量的影响

以玉米糖化液为碳源，设置玉米糖化液质量浓度梯度，相同条件培养48 h，测定γ-PGA产量。

玉米糖化液质量浓度对γ-PGA产量的影响见图6。

图6 玉米糖化液质量浓度对γ-PGA产量的影响

由图6可知，玉米糖化液质量浓度为100g/L时γ-PGA产量最大，最大产量为5.04g/L，由此可得玉米糖化液最优质量浓度为100g/L。

3.2.4 前体物谷氨酸钠质量浓度对γ-PGA产量的影响

在基础培养基中分别加入20，30，40，50，60，70 g/L的谷氨酸钠，碳源、氮源以优化后的为准，其他成分与基础发酵培养基一致，培养方法如前，测定其最佳质量浓度，48 h后测定γ-PGA产量。

前体物质量浓度对γ-PGA产量的影响见图7。

图7 前体物质量浓度对γ-PGA产量的影响

由图7可知，前体物质量浓度为30 g/L时γ-PGA产量最大，最大产量为5.25 g/L，由此可得前体物聚氨酸钠最优质量浓度为30 g/L。

3.2.5 氯化钠质量浓度对γ-PGA产量的影响

在基础培养基中分别加入6，8，10，12，14，16 g/L的氯化钠，碳源、氮源、前提物以优化后为准，培养方法同上，48 h后测定γ-PGA产量。

氯化钠质量浓度对γ-PGA产量的影响见图8。

图8 氯化钠质量浓度对γ-PGA产量的影响

由图8可知，氯化钠浓度为10 g/L时γ-PGA产量最大，5.87 g/L，由此可得氯化钠最优质量浓度为10 g/L。

3.2.6 金属离子的种类及质量浓度对γ-PGA产量的影响

在以上培养基优化的基础上，选择硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸锰3种金属化合物作为金属离子的添加药品，分别设置其质量浓度梯度，培养方法同上，48 h后测定γ-PGA产量。

硫酸镁质量浓度对γ-PGA产量的影响见图9，磷酸二氢钾质量浓度对γ-PGA产量的影响见图10，硫酸锰质量浓度对γ-PGA产量的影响见图11。

图9 硫酸镁质量浓度对γ-PGA产量的影响

图10 磷酸二氢钾质量浓度对γ-PGA产量的影响

由图9~图11可知，磷酸二氢钾质量浓度为0.3 g/L时γ-PGA产量最大，11.78 g/L，由此可得最优金属离子为钾离子，磷酸二氢钾最优质量浓度为0.3 g/L。

图11 硫酸锰质量浓度对γ-PGA产量的影响

3.2.7 发酵时间对γ-PGA产量的影响

使用以上优化培养基，设置发酵时间梯度，测定不同发酵时间发酵液中γ-PGA含量。

发酵时间对γ-PGA产量的影响见图12。

图12 发酵时间对γ-PGA产量的影响

由图12可知，发酵时间为72 h时γ-PGA由最大产量24.27 g/L，由此可得最优发酵时间为72 h。

4 结论

从传统大豆发酵食品、黄水、黄浆水、酸菜水中筛选出一株γ-PGA产生菌株，经形态分析、生理管鉴定和16S rDNA序列鉴定为枯草芽孢杆菌，并将此菌株命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisYB18.）设计梯度试验对培养基各个成分进行了优化，在试验条件下该菌株的最佳氮源为牛肉浸粉，其最佳质量浓度为11 g/L；最佳碳源为玉米糖化液，其最佳质量浓度为100 g/L；谷氨酸钠作为前体物，其最佳质量浓度为30 g/L；氯化钠最佳质量浓度为10 g/L；最优金属离子为磷酸二氢钾所提供的钾离子，其最佳质量浓度为0.3 g/L，最佳发酵时间为72 h，采用优化培养基配方进行发酵，所得γ-PGA的产量为24.27 g/L。