复合果蔬汁的发酵工艺及风味品质研究

张路遥，张洁玮，李梦迪，楚玉柔，施泽轩，韩 梅

(上海商学院酒店管理学院，上海 200235)

水果和蔬菜被认为是理想的益生菌天然培养基，不仅感官上很受欢迎，还含有丰富的营养物质，如矿物质、维生素、膳食纤维和抗氧化物质等[1]。在经过益生菌发酵后，会有一些风味、色泽、营养成分等品质的变化，赋予产品新的发酵风味[2-5]，如降低产品的pH而使一些如花青素等在酸性环境较稳定的营养物质能够更好地保存[6-8]，提高产品贮藏性的同时，增加了其营养价值。简而言之，益生菌能够利用水果和蔬菜中丰富的碳水化合物、蛋白质、维生素等，将这些营养成分代谢转换为小分子活性物质，如氨基酸、酶类、有机酸等。这样不仅保留了天然果香，还增加了营养密度[9]。

发酵果蔬汁饮料丰富了果蔬制品的营养性及功能性，与当代人们的绿色、天然、健康和营养饮食消费习惯相吻合，而复合型果蔬汁更符合消费者的喜好和现代饮料的发展趋势[10-11]，具有广阔的市场前景。美国、德国、日本等国家已经研发了一些发酵果蔬饮料，如日本的一种新型发酵蔬菜饮料——“蔬菜战士”，颇受市场欢迎[12]。近年来，国内的研究人员一直在尝试利用益生菌发酵果蔬汁。众多研究者通过氨基酸分析仪、GC-MS等方法分析各果蔬汁发酵前后挥发性风味物质、氨基酸和糖等成分的变化，探讨了乳酸菌发酵对果蔬汁感官品质及适配性问题的影响，如使用植物乳杆菌发酵单一的果蔬汁（橙汁、青瓜汁、苹果汁、葡萄汁和梨汁），发现乳酸菌发酵代谢对不同果蔬汁风味影响差异较大[13-14]，植物乳杆菌发酵胡萝卜原浆后提升了质构和抑菌性[15-16]，还可以提升铁的溶解性[6]，石榴汁中使用乳酪杆菌和植物乳杆菌单一菌株发酵后品质提升[17]。

近年来多数研究是利用酸奶中常用的益生菌对单一果蔬汁进行发酵工艺的优化，但对复合果蔬汁的不同菌种发酵工艺的研究较少[14]。鉴于此，作者采用单因素试验对发酵复合果蔬汁的发酵时间、果蔬种类、发酵菌种进行研究，优化最适的果蔬种类、菌种及发酵工艺参数，探讨影响发酵果蔬汁风味物质的变化规律，以期为提高果蔬汁的营养价值、满足消费者的需求以及解决果蔬利用率等问题提供思路，同时期望能为生产高品质的益生菌发酵果蔬汁、开发更多发酵制品的研究提供较为系统研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂 脐橙、水晶梨、苹果、黄瓜、芒果、圣女果、胡萝卜和紫甘蓝，市售；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum, Vege-Start2.0 CN )和副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracaseiL. casei 431），丹麦科汉森公司；SY 葡萄酒·果酒专用酵母，安琪酵母股份有限公司；马克思克鲁维酵母菌和瑞士乳杆菌，上海商学院实验室；MRS 固体培养基。

1.1.2 仪器与设备 LDZX-50FBS 立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗机械厂；GXM-0258A 智能光照培养箱，宁波江南仪器厂；AL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；B79 多功能高速破壁料理机，上海恒联厨具有限公司；HWS-26电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；FG2便携式pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PAL-1 手持折光仪，日本爱拓公司；XW-80A 微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；GC2010-QP2010 Ultra气相色谱质谱联用仪，日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 果蔬汁前处理 将脐橙、芒果洗净并去皮，苹果、水晶梨、胡萝卜、圣女果、紫甘蓝、黄瓜洗净，取可食用的果肉，全部切成小块，随后用榨汁机分别榨汁，按2:1的料液比加水、过滤，获得澄清果蔬汁。每200 mL分装于容量为250 mL的洁净灭菌玻璃瓶中，密封。

1.2.2 接种前灭菌 用水浴锅将果蔬汁加热至90 ℃，保持10 min，然后冷却至室温，准备接种。

1.2.3 接种与发酵 植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的接种量为每100 g果蔬汁接种0.004 g菌粉。果酒酵母和马克思克鲁维酵母菌的接种量为0.04%，瑞士乳杆菌接种1%的菌液1 mL。若两个菌种复合发酵则各加一半的接种量。接种前先量取20 mL蒸馏水于离心管中，灭菌后将计算好的相应质量的菌粉加入离心管中活化，再用移液枪取1 mL置于果蔬汁中，摇晃均匀。将接种完的果蔬汁放入30 ℃恒温培养箱中静置发酵。

1.2.4 糖酸调配 根据发酵后果蔬汁的滴定酸度，计算调配出6%的含糖量、60 °T左右滴定酸度最终成品所需的糖水添加量，使果蔬汁稀释到合适的酸甜比例，拥有更好的风味。

1.2.5 指标测定 活菌数：参考GB 4789.35—2016，采用稀释平板计数法进行测定；pH：参考GB 5009.237—2016；糖度：参照GB/T 12143-2008中折光计法；滴定酸度：参考GB 5009.239—2016 酚酞指示剂法中发酵乳的测定方法。由于果蔬汁颜色丰富，无法观察到酚酞指示剂的颜色变化，修改滴定终点为pH 7.0。

1.2.6 感官评价 感官评价小组由20名经过培训的食品专业人员组成，对样品的气味、口味和表观、总体接受度进行评分。最终各样品的感官评分取感官评价小组的平均分，评分标准见表1。

表1 发酵果蔬汁的感官评分标准Table 1 Sensory evaluation of the fermented fruit and vegetable juice

1.2.7 挥发性风味物质的GC-MS测定 样品前处理方法：采用水——有机溶剂混合萃取法，称取4 g样品；连接水蒸气蒸馏装置，量取50 mL水和50 mL正己烷于蒸馏瓶中，在恒温水浴锅内80 ℃蒸馏30 min，待不再有馏液出现时，停止蒸馏；取上层液加入无水硫酸铜粉末，震荡后静止5 min后，过 0.45 μm 有机相滤膜于进样瓶中。

GC-MS条件根据李汴生等[14]的方法略作修改。色谱条件：载气为He气（纯度 ≥ 99.999%），流速1.93 mL·min-1。进样口温度为250 ℃，进样方式为不分流进样。升温程序条件是起始温度为40 ℃，保持3 min 后以4 ℃·min-1的速度升温至120 ℃，再以6 ℃·min-1的速度升温至240 ℃，保持9 min。质谱条件：采用电子轰击电离，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，接口温度为230 ℃，质量扫描范围为质荷比35～500。

1.2.8 图表绘制及数据分析 数据需要重复测定3次，采用SPSS 22.0来处理和分析数据，应用Origin Pro 9.0进行作图。

2 结果与分析

2.1 菌种对发酵的影响

以脐橙、水晶梨、苹果、黄瓜、胡萝卜、圣女果和紫甘蓝混合的复合果蔬汁为原料，分别接种适量的植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌和果酒酵母，测定发酵过程中的pH、滴定酸度和糖度随发酵时间的变化。结果（图1）显示，除果酒酵母外，不同乳酸菌发酵后的pH、滴定酸度和糖度差异不明显，但发酵过程中产酸、糖分解速率各不相同，果酒酵母与其他菌发酵后各项指标有明显的区别，其发酵后糖度大量减少，最后酸度最低。各菌种发酵的果蔬汁在发酵了48 h后，各指标变化速率降低。各乳酸菌中植物乳杆菌产酸最快，其次是副干酪乳杆菌和瑞士乳杆菌，选用此3种菌作为复配菌种进行发酵，其发酵后的pH和滴定酸度变化较快，发酵后活菌数lg CFU显著高于副干酪乳杆菌和瑞士乳杆菌，而与植物乳杆菌无显著差异。

图1 菌种对混合果蔬汁发酵结果的影响Figure 1 Effects of strains on fermentation results of the mixed fruit and vegetable juice

由于过酸会导致果蔬汁的风味不佳[14]，营养物质减少，从而导致活菌数下降，酸度一般控制在60至70 ° T为宜，而各乳酸菌种发酵的复合果蔬汁在发酵了48 h后酸度适中，由此采用植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和瑞士乳杆菌复配发酵48 h为宜。

2.2 果蔬种类对发酵结果的影响

将脐橙、水晶梨、苹果、黄瓜、芒果、圣女果、胡萝卜和紫甘蓝榨汁、过滤后，分别接种植物乳杆菌进行发酵，测定其初始、发酵24和48 h的pH值、滴定酸度和糖度。结果（图2）表明，产酸较多的果蔬种类为胡萝卜、圣女果、紫甘蓝、橙子和芒果，而发酵后活菌数结果显示苹果汁、梨汁、黄瓜汁、橙汁和紫甘蓝的活菌数9.0 lg（CFU·mL-1）低于其他几种发酵果蔬汁的活菌数低9.5 lg（CFU·mL-1）。因此，综合风味和活菌数含量，最终选取芒果、圣女果和胡萝卜作为果蔬汁的复合配方。

图2 果蔬种类对发酵产品的影响Figure 2 Effects of fruit and vegetable species on fermentation products

2.3 感官评价结果

用植物乳杆菌单菌种发酵芒果汁、圣女果汁、胡萝卜汁及它们的复合果汁，并应用混合菌种发酵胡萝卜汁，分别得到发酵芒果汁、发酵圣女果汁、发酵胡萝卜汁、胡萝卜复菌及发酵复合果蔬汁5种样品，并进行糖蒜调配后，进行感官评价，结果如图3所示。

图3 发酵果蔬汁的感官评价结果Figure 3 Sensory evaluation of the fermented juices

图3显示，发酵果蔬汁经过糖酸调配后感官评价结果明显提高，果蔬汁具有明显的发酵风味，由于调味前过多的酸度会影响果蔬汁的总体风味[14]，调配后果蔬汁呈现更好的感官接受度，与调配前的发酵果蔬汁相比，发酵果蔬汁在外观、香气的感官评价得分上变化不明显，而在酸度、滋味和接受程度上，有明显的改善；合适的酸甜比使得发酵果蔬汁的果蔬风味和发酵风味产生相乘作用，极大地提高了发酵胡萝卜汁和发酵圣女果汁的感官接受度，复合果蔬汁也得到一定提高；发酵复合果蔬汁与发酵芒果汁、圣女果汁和胡萝卜汁相比具有更好的感官接受度。

2.4 GC-MS风味成分分析

通过气质色谱质谱联用仪对各个发酵24 和48 h及调配后的单一果蔬汁和发酵复合果蔬汁进行挥发性风味物质的测定，具体见表2。

表2 不同发酵果蔬汁的风味物质Table 2 Changes of the main volatile compounds in different juices after fermentation

由表2可知，GC-MS检测出混合果蔬汁固有的风味物质主要为萜烯类、少量酯类和酸类，在混合菌种发酵24 h后挥发性风味成分数量增多，酯类风味含量有较大增加，其次为酸类、醇类，且发酵48 h后有进一步的增加；这种变化是果蔬汁在乳酸菌的代谢导致的，酸类增加，并与醇酯化成酯类风味；醇类、酯类和酸类的挥发性风味物质赋予了混合果蔬汁浓郁的水果香味；混合果蔬汁在混合菌种的发酵48 h后风味更丰富，风味特性更加饱满，因此最适发酵时间为48 h。

3 结论

开发高品质的益生菌发酵复合果蔬汁，得到的最佳工艺为选择芒果、圣女果和胡萝卜为符合果蔬汁原料，以植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和瑞士乳杆菌复配发酵48 h的制品pH低，酸度较高，活菌数高，感官评价结果质量最优；GC-MS风味分析表明，发酵过程中酯类、醇类和酸类的挥发性风味物质相对增加，风味较好。