粮食真菌毒素含量检测结果的误差分析

◎ 于 鹤，申兆燕，王杰夫，刘 畅，杨思成

（1.中央储备粮阜新直属库有限公司，辽宁 阜新 123000；2.黄冈市公共检验检测中心，湖北 黄冈 438000）

真菌毒素是真菌在适宜条件下产生的一种低分子量的次生代谢物，大多数真菌毒素可抑制动物体内蛋白合成，破坏细胞结构，进而影响动物体肝脏、肾脏、造血等组织器官的正常工作，具有较强的致癌、致畸、致突变作用，对人和动物的生存与健康造成了重大威胁[1]。在谷物及其制品中，常见的真菌毒素有黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮毒素（Zearalenone，ZEN）、呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）等[2]。真菌毒素污染是不可忽视的问题，为防止粮食在流通环节存在质量安全风险，《粮食流通管理条例》中真菌毒素已被列为必检项目[3]。粮食卫生标准GB 2761—2017中规定，真菌毒素限量指标应符合表1要求[4]。

表1 粮食中真菌毒素限量要求表（单位：μg·kg-1）

粮食生霉粒、霉变粒含量的高低与真菌毒素含量多少无明显正相关性，不可通过霉变情况判断真菌毒素含量，真菌毒素检测值高低主要与粮食是否感染产毒霉菌有关[5]。粮食在生长、运输、存储和加工等环节都会受到真菌入侵，在宿主、光照、温度、水分活度等适宜环境条件下，产毒霉菌会产生真菌毒素，产生的真菌毒素具有随机性、分布不均—的特点[6]，且真菌毒素通常只有ppm或ppb级别（ppm级别相当于32 kg粮食中的一颗）[7]，致使准确检测谷物中真菌毒素的含量十分困难。

1 影响粮食真菌毒素含量检测结果的因素

同其他检测项目一样，粮食真菌毒素含量的检测也包括抽样、制样、分析检测等步骤。每个步骤都会不可避免的引入误差，对检测结果造成直接或间接的影响[8]。

1.1 扦样环节对粮食真菌毒素含量检测结果的影响

扦样是粮食真菌毒素检测的第一步，直接影响检测结果的准确性，如果扦样方法不合理、样品数量不具代表性，任何精密仪器的分析结果将毫无意义。在粮食储运中常见的扦样类型有运粮汽车扦样（对入库车辆进行自动扦样器扦样）和静态粮仓扦样（人工对不同扦样点进行电动吸风机扦样），见图1[9]。

图1 扦样示意图

扦样要做到多点、随机、均匀，使得每个部位都有相同的概率被取到。《粮食、油料检验扦样、分样法》（GB 5491—1985）对扦样方法作出了明确要求，尤其在仓房扦样中需做到分区设点、分层扦样[10]，粮库扦样点位如图2所示。

图2 粮库扦样布点示意图

在高大平房仓的扦样中，每区面积不超过50 m2，各区设中心4角共5个点，两区边界的点为共有点，粮堆边缘的点设在距边缘50 cm处；粮堆高度在23 m，分上、中、下3层，上层在粮面下10~20 cm处，中层在粮堆中间，下层在距底部20 cm处，堆高在35 m，应分4层；在圆筒仓扦样中，每层按圆筒仓直径分内（中心）、中（半径的一半处）、外（距仓边30 cm处）3圈。直径在8 m以下的，每层按内中外设1、2、4共7个点，直径在8 m以上的，每层按内中外设1、4、8共13个点。按区按点，从上至下，逐层扦样。

扦样点对真菌毒素检测结果的影响较大，余敦年等[11]对粮仓不同空间位置的稻谷进行检测后发现，上、中、下层的黄曲霉B1含量均存在差异，近墙部位黄曲霉B1含量和超标率较大，中层黄曲霉B1含量高于其他部位。同时各点受真菌毒素的污染情况不一样，有些粮堆中受真菌污染的粮食颗粒少，但受污染的颗粒真菌毒素含量极高[12]，致使检测结果超标。在储藏过程中，随着粮堆水分和温湿度的改变，受侵染的区域还会发生虫霉交替的演变，适应环境的菌种会更有利于生长，受感染粮粒的真菌毒素含量和类型随之改变。粮库扦样过程中，不同空间位置和不同粮粒受真菌毒素污染程度差异较大，是检测结果的主要误差来源。

扦样量也会对真菌毒素的检测结果造成差异影响，表2为在一卡车玉米中加标20 μg·kg-1的黄曲霉毒素污染情况[13]。从表2可以看出，在一卡车中扦样量取4.50 kg，玉米黄曲霉毒素检测范围在11.6~28.4 μg·kg-1；在一卡车中扦样量取0.45 kg，检测范围在0~46.9 μg·kg-1。由此可见，适当提高扦样量可减小检测结果的误差。原料扦样后按照分样器法进行分样，分出约1 kg样品进行混匀[14]，这样可以保证检测的最低检测量和检测样品的霉菌毒素的分布均一性。

表2 一卡车玉米中有20 μg·kg-1黄曲霉污染的情况表

1.2 制样环节对真菌毒素含量检测结果的影响

样品的均匀性是制样环节的主要误差，在粮食入库时节，基层检验员在使用快捷设备进行真菌毒素检测时发现，同一样品的不同粉末检测结果相差较大，而取同一提取液的检测结果平行性良好，制粉的均匀性问题给收粮工作带来很大困扰，尤其是对超标附近的检测结果难以把控。从真菌毒素在粮食颗粒的分布来看，不同部位含量也有所差异。对一批黄曲霉毒素超标的稻谷进行液相分析，发现碾磨后的精米中黄曲霉毒素B1含量在正常范围内，糙米中黄曲霉毒素B1含量较高，而糠粉中黄曲霉B1含量最高，且占稻谷籽粒黄曲霉毒素B1含量的90%。为保证样品的均匀性，需要选择合适的研磨方式对脱壳后的糙米进行研磨，研磨产生的颗粒足够小，可使制成的样品均匀性良好，从而减少平行样品间的变异性，减小分析误差。GB 5009.22—2016规定谷物粉碎后的粒径通过2 mm孔径试验筛，在称样前建议先搅拌摇匀，再进行下一步的仪器设备分析。

次级分析样品的取样量也会对真菌毒素的检测结果造成影响。王松雪等[15]对总体黄曲霉污染水平为20 ng·g-1的样品进行薄层色谱分析，发现次级分析样品的取样量从50 g提高到100 g，测定结果范围从（20±36.9）ng·g-1降低为（20±20.5）ng·g-1，适当提高次级分析样品的取样量，可减少真菌毒素的分析误差。在制样过程中，如果只是简单地减少样品量大小，直接取少量的样品进行研磨，会进一步降低样品的代表性，在研磨前建议用四分法分出约100 g样品进行脱壳、制粉。

1.3 分析方法对粮食真菌毒素含量检测结果的影响

近年对分析检测过程中的误差研究较多，主要集中在送检到实验室后样品的提取、净化、分离和检测上，目前已建立了一系列的检测标准和方法，常见的有高效液相色谱法、免疫层析法等，各种方法的特点如表3所示。

表3 不同分析方法检测真菌毒素含量比较表

免疫层析法法更适用于批量样品的初筛，容易出现假阴性和假阳性结果，难以用于准确定量分析。在定量分析检测中，高效液相色谱法具有精准度高、检出限低、灵敏度强的优势，大大减少了分析检测过程中引入的误差，是粮油质检机构出具检测报告的常用方法。另外，近年来全自动免疫磁珠净化仪等前处理装置的研发，避免了液相过亲和柱、氮吹等前处理步骤，解决了液相前处理操作烦琐的问题[23]。随着新技术的发展，真菌毒素检测研究开始出现在纳米材料和识别原件上，运用微流控技术、拉曼光谱等新技术构建真菌毒素指纹图谱，结合智能化手机可实现真菌毒素的实时在线监测[24]，但作为新技术在真菌毒素的准确定量分析上还存在不足，需要进一步研究和完善。

2 结语

目前在分析方法上，运用大型精密设备基本可避免出现真菌毒素检测的误差问题，然而，扦样和制样过程中引入的误差仍亟待解决。现有的粮油扦样标准对于扦样方法和扦样量只做了简单介绍，实际工作中难以对不同运粮车辆、不同仓型和仓容的粮库在扦样要求上形成统一。因此，还需要进一步规范真菌毒素检测的具体扦样步骤。在制样过程中，人工分样、机械研磨等步骤也都会造成真菌毒素分布不均一，而引入具备充分混匀样品能力的自动分样器和连续粉碎装备可减少误差来源。只有完善扦样和制样过程中的具体规定，避免真菌毒素分布分布不均一问题，才能从根本上减小粮食真菌毒素检测的误差。