乌蔹莓不同提取物软膏对急性痛风性关节炎模型大鼠的治疗作用及其机制研究

朱凌云 许倩倩 包贝华 曹亮亮 赵学龙 张 丽 焦 放

（1.南京市第二医院，江苏南京 210003；2.南京中医药大学药学院，江苏南京 210023；3.南京市中医院，江苏南京 210022）

痛风是一种以尿酸水平升高为特征的代谢性风湿病，全球患病率约10%，已成为我国第二大类代谢疾病。痛风性关节炎（gouty arthritis，GA）是由于单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）结晶沉积关节组织周围致炎，是痛风的关键病理过程之一[1-2]。痛风属中医学“痹证”“历节病”范畴，中药多靶点的特性在降尿酸、抗炎和改善关节功能方面有较好的作用，在控制病情发展、减少复发、降低不良反应率等方面有着独特优势[3-4]。向关节腔内注入尿酸钠晶体造成急性痛风性关节炎（AGA）病变模型，其病理表现与临床极为相似，已广泛用于实验研究[5-8]。

乌蔹莓为葡萄科乌蔹莓属植物乌蔹莓Cayratia japonica（Thunb.）Gagnep.的全草，具有清热利湿、解毒消肿之功效，主治热毒痈肿、疔疮、丹毒、风湿痹痛、黄疸等。乌蔹莓膏是南京市中医院的医院制剂，已应用于临床30余年，对肛周脓肿、痛风性关节炎、风湿性关节炎和腰痛等症均有良好的疗效[9]。但目前其制备工艺仅为打粉入药，工艺较粗糙，有待优化，也缺少对其治疗痛风性关节炎作用的深入研究报道。

本研究通过制备大鼠急性痛风性关节炎模型，并给予乌蔹莓不同提取物软膏进行干预，通过测定核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性体轴的炎症因子——肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）水平，比较乌蔹莓不同提取物软膏对大鼠急性痛风性关节炎的治疗作用，并初步探索其作用机制，为后续乌蔹莓软膏的改良提供一定的实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物清洁级SD大鼠，雄性，体质量160～180 g，由浙江省动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK（浙）2014-0001。本实验符合国家及南京中医药大学实验动物中心规定的伦理学要求。

1.2 药物与试剂乌蔹莓软膏，实验室自制，原料乌蔹莓饮片（批号：20181201）购自安徽亳州；尿酸钠（批号：BCBH7155V），购自上海源叶生物科技有限公司；黄凡士林（批号：20180801），购自南昌白云药业有限公司；扶他林软膏（批号：20180707），购自北京诺华制药有限公司。TNF-α ELISA试剂 盒（规 格：96T，批 号：20190105004，品 牌：MALLBIO）；IL-1β ELISA试 剂 盒（规 格：96T，批号，20190103003，品 牌：MALLBIO）；IL-6 ELISA试剂盒（规格：96T，批号：20190108009，品牌：MALLBIO）。

1.3 主要仪器多功能酶标仪（Rayto RT-6100）；台式高速离心机（规格型号：Micro CL21R）；KH-500B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电 子 天 平（METTLER TOLEDO MS-105DU，d=0.01 mg）；超纯水（Milli-Q超纯水系统制备）；XFB-200型高速中药粉碎机（吉首市中诚制药机械厂）；DZF-6050减压干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；DHG-9246A电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

2 实验方法

2.1 乌蔹莓不同提取物软膏制备乌蔹莓打粉软膏：乌蔹莓饮片直接粉碎，过六号筛，按高剂量（相当于生药浓度0.60 g/g），加入凡士林研磨均匀。乌蔹莓水提物低、中、高剂量软膏：最粗粉加10倍量的水回流提取2次，每次2 h，合并滤液后浓缩得稠浸膏，按低、中、高剂量（相当于生药浓度分别为0.15、0.30、0.60 g/g），分别加入凡士林研磨均匀。乌蔹莓醇提物低、中、高剂量软膏：最粗粉加10倍量的95%乙醇溶液回流提取2次，每次2 h，合并滤液后浓缩得稠浸膏，按低、中、高剂量（相当于生药浓度分别为0.15、0.30、0.60 g/g），分别加入凡士林研磨均匀。乌蔹莓先醇提后水提物软膏：最粗粉加10倍量的95%乙醇溶液回流提取2次，每次2 h，合并滤液，滤渣加10倍量的水回流提取2次，每次2 h，合并滤液，最终将醇提和水提的滤液合并浓缩得稠浸膏，按高剂量（相当于生药浓度0.60 g/g），加入凡士林研磨均匀。

2.2 造模与分组、给药88只SD大鼠适应性饲养5 d，随机取8只为空白组，剩余80只为造模组。称取0.5 g尿酸钠结晶加入50 mL无菌生理盐水中，加温搅拌制成10 mg/mL尿酸钠悬浊液，4 ℃保存，用前摇匀。造模组大鼠用戊巴比妥钠麻醉，向右侧后肢踝关节腔内注入0.5 mL尿酸钠混悬液。空白组注射等体积生理盐水。

造模12 h后所有造模组大鼠步态、关节炎症指数以及关节肿胀率均显著高于空白组，说明造模成功。将造模组大鼠随机分为模型组、阳性药物组、乌蔹莓打粉组、乌蔹莓先醇提后水提组和乌蔹莓水提低、中、高剂量组，以及乌蔹莓醇提低、中、高剂量组，每组8只。各治疗组于造模后12 h开始涂抹给药，药物均匀抹于肿胀处，用纱布包裹后包扎好，分别于首次用药后每隔12 h换药，连续给药5次。空白组不涂抹，模型组涂抹等量凡士林。涂抹量：每次涂抹一小茶匙，约0.5 g，折合给药剂量，乌蔹莓水提和醇提低、中、高剂量分别为0.375、0.75、1.5 g/kg，乌蔹莓打粉组、先醇提再水提组的给药剂量为1.5 g/kg，阳性药物组予双氯芬酸二乙胺乳胶剂（扶他林软膏），给药剂量为6.682 g/kg。

2.3 指标检测

2.3.1 计算关节肿胀率造模前用记号笔在各组大鼠右侧后肢踝关节上方约1 cm处划线，以备检测周长。造模前与造模后12、24、36、48、60 h分别用软卷尺于划线处测量各组大鼠右侧后肢踝关节周长，计算肿胀率。计算公式：肿胀率（%）=（致炎后踝关节周长－致炎前踝关节周长）/致炎前踝关节周长×100%。

2.3.2 评价步态与关节炎症指数[10]根据Coderre的步态分级评定标准，于造模后24 h观察各组大鼠步态。步态指数：0分，正常步态，4足均匀着地；1分：轻微跛行，右膝关节略有弯曲；2分：跛行，右下肢只接触地面；3分：严重跛行，右下肢离开地面，三足步态。于造模后24 h观察各组大鼠踝关节肿胀程度，评价关节炎症指数。0分：正常；1分：关节皮肤出现红斑、轻度肿胀；2分：关节皮肤红肿且仅关节部位红肿；3分：关节以外亦见红肿。

2.3.3 测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量给药5次后，各组大鼠麻醉，腹主动脉取血，静置0.5 h，离心取上层血清，按照ELISA试剂盒说明书严格操作，进行检测。

2.4 统计学方法采用SPSS软件进行数据分析。数据均以（±s）表示，步态、大鼠炎症指数等资料采用秩和检验，组间比较采用ANOVA方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠实验各时期关节肿胀率比较造模后12 h，模型组与各给药组关节肿胀度均显著高于空白组（P＜0.05，P＜0.01），说明模型制备成功。随着给药次数的增加，各给药组的关节肿胀率均呈下降趋势，其中乌蔹莓水提高剂量组在各个时间点的肿胀率均为最低，于造模后36、48 h明显低于同时期模型组（P＜0.05，P＜0.01）。其余各组组间比较均未见统计学差异，考虑可能与样本数较小及测量误差有关。详见表1。

表1 各组大鼠各时期踝关节肿胀率比较（±s）

表1 各组大鼠各时期踝关节肿胀率比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 动物数/只 关节肿胀率/%造模后12 h 造模后24 h 造模后36 h 造模后48 h 造模后60 h空白组 8 0 0 0 0 0模型组 8 15.46±9.36* 16.83±10.01 10.91±4.00 9.54±3.02 7.28±3.10阳性药物组 8 18.57±5.69** 12.59±5.12 9.32±3.77 7.86±4.18 4.98±2.81乌蔹莓打粉组 8 20.82±8.52** 16.69±6.24 11.24±5.04 10.81±5.52 7.20±6.95乌蔹莓水提低剂量组 8 21.03±7.77** 16.24±7.24 9.57±7.23 8.25±7.46 5.96±5.45乌蔹莓水提中剂量组 8 20.11±11.61**13.03±9.73 9.84±8.23 8.45±7.71 5.69±6.61乌蔹莓水提高剂量组 8 16.06±5.50* 9.15±7.09 5.97±3.75# 4.58±2.48## 3.69±3.21乌蔹莓醇提低剂量组 8 15.83±11.12*14.49±7.08 9.06±6.00 7.26±4.10 4.55±3.94乌蔹莓醇提中剂量组 8 21.71±8.34** 16.73±6.32 9.93±5.09 9.50±5.20 6.42±4.61乌蔹莓醇提高剂量组 8 19.31±8.34** 16.19±7.18 8.40±5.44 7.81±5.24 6.26±5.04乌蔹莓先醇提后水提组 8 18.75±7.01** 14.64±5.71 10.45±4.84 8.63±4.35 6.35±4.39

3.2 各组大鼠造模24 h后步态、关节炎症指数比较与空白组比较，模型组大鼠步态较差、关节肿胀严重，步态、关节炎症指数比较差异有统计学意义（P＜0.01），说明造模成功。与模型组比较，各给药组大鼠步态、关节炎症指数均有所降低，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表2。

表2 各组大鼠造模后24 h步态、关节炎症指数比较（±s） 单位：分

表2 各组大鼠造模后24 h步态、关节炎症指数比较（±s） 单位：分

注：与空白组比较，**P＜0.01。

组别 动物数/只 步态指数 关节炎症指数空白组 8 0.00 0.00模型组 8 2.00±0.67** 1.38±0.66**阳性药物组 8 1.83±0.64 1.33±0.44乌蔹莓打粉组 8 1.88±0.57 1.25±0.67乌蔹莓水提低剂量组 8 1.63±0.66 1.25±0.62乌蔹莓水提中剂量组 8 1.63±0.94 1.38±0.46乌蔹莓水提高剂量组 8 1.00±0.94 0.75±0.62乌蔹莓醇提低剂量组 8 1.25±0.78 1.13±0.74乌蔹莓醇提中剂量组 8 1.63±0.81 1.25±0.62乌蔹莓醇提高剂量组 8 1.40±0.45 1.00±0.00乌蔹莓先醇提后水提组 8 1.50±0.82 1.00±0.67

3.3 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较见图1。与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。与阳性药物组比较，乌蔹莓不同提取物组IL-1β含量均显著下降（P＜0.01），乌蔹莓打粉组、先醇提后水提组、醇提各剂量组和水提中、高剂量组IL-6含量均显著下降（P＜0.01），乌蔹莓先醇提后水提组以及水提和醇提中、高剂量组TNF-α含量均显著下降（P＜0.01）。与打粉组比较，乌蔹莓醇提高剂量组和先醇提后水提组IL-1β含量均显著下降（P＜0.05，P＜0.01），乌蔹莓先醇提后水提组、水提高剂量组、醇提高剂量组IL-6含量均显著下降（P＜0.01），乌蔹莓先醇提后水提组、水提高剂量组和醇提中、高剂量组TNF-α含量均显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。上述指标乌蔹莓水提和醇提低、中、高剂量组均呈现出剂量效应，剂量越高，炎性因子含量越低，越向空白组水平回归。对于上述炎性因子的改善作用，乌蔹莓醇提高剂量组效果最优。

图1 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较（±s，n=8）

4 讨论

随着人们生活水平的提高，高尿酸血症和痛风的发病率日益增高，西药治疗效果明显，但停药容易复发，长期使用易引起各种不良反应。中药内服外用治疗痛风，经过大量的临床实践证明有效[11]。乌蔹莓软膏治疗痛风性关节炎临床疗效良好，但还需进一步改良制备工艺，并深入研究其作用机制。本实验通过建立大鼠急性痛风性关节炎模型，给予乌蔹莓不同提取物软膏治疗，比较各组药物对痛风性关节炎的疗效及对相关炎症因子的影响，为后续乌蔹莓软膏活性成分群筛选、优化制备工艺提供参考。

尿酸盐晶体作为诱发痛风的关键物质，在体内高尿酸水平达到饱和程度后形成尿酸盐沉积，进而促发TNF-α、IL-1β等炎性因子的释放，启动炎症级联反应。外源注射尿酸盐是建立痛风性关节炎动物模型的经典方法，注射尿酸盐2~3 h后模型逐渐形成，24 h造模效果达到高峰，具有操作简单、模型稳定的特点。本实验复制大鼠急性痛风性关节炎大鼠模型，造模大鼠步态、关节炎症指数以及关节肿胀度均显著高于空白组，说明造模成功。根据预实验结果，尿酸钠致炎后24 h大鼠踝关节肿胀率最高，此后即使不做干预，症状亦逐渐缓解，故于造模后24 h比较各组大鼠步态、炎症指数，结果表明各治疗组步态、炎症指数均较模型组改善，但与模型组比较或两两比较差异均无统计学意义，后续将做进一步研究。随着时间的增加，各治疗组大鼠关节肿胀率均呈下降趋势，其中乌蔹莓水提高剂量组在造模后36、48 h关节肿胀率明显低于同时期模型组（P＜0.05，P＜0.01），其余各组组间比较均未见统计学差异，考虑可能与样本数较小及测量误差有关。

大量研究表明，NLRP3炎性体活化与巨噬细胞吞噬尿酸钠晶体密切相关，MSU结晶可通过多种途径活化NLRP3炎性体，促进IL-1β释放，并与靶细胞如滑膜细胞上的IL-1受体结合，激活MyD88依赖的核转录因子κB（NF-κB）通路，引起大量的TNF-α等促炎因子和趋化因子转录，介导痛风炎症反应[12-16]。本研究结果表明，与空白组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著升高，而与模型组比较，乌蔹莓不同提取物组上述血清炎症因子含量均显著降低，提示乌蔹莓软膏治疗痛风性关节炎的作用可能与抑制NLRP3炎症信号通路活化有关，后续需进一步验证。从本研究结果可以看出，干预后乌蔹莓醇提高剂量组和先醇提再水提组上述炎症因子均明显低于打粉组，水提高剂量组血清IL-6、TNF-α含量明显低于打粉组，其中以醇提高剂量组对炎症因子的改善作用最佳。在关节肿胀率的改善方面，乌蔹莓水提高剂量组效果最佳，而炎症因子测定结果发现醇提高剂量效果最佳，考虑到本模型主要是由炎症引起，并且醇提物得率较水提物低，更利于后续制剂工艺优化，故综合考虑可选用乌蔹莓醇提物制备乌蔹莓软膏。

前期对乌蔹莓成分的分析表明，其主要含有黄酮苷及苷元类成分，如木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素等，且不同提取方式各成分种类及含量差异较大，醇提部分含黄酮苷元成分较多[17]。此外，有研究表明木犀草素可通过下调TLR/MyD88/NF-κB通路减轻急性痛风性关节炎的炎症反应[18]。故后续研究一方面可以进一步优化乌蔹莓总黄酮类成分提取精制工艺，另一方面可针对NLRP3炎症信号通路进行深入研究，从而阐明乌蔹莓黄酮类成分对痛风性关节炎的物质基础和作用机制，在此基础上可以优化乌蔹莓软膏的制备工艺，也可以开展新剂型研究，从而更好地应用于临床。