高血压病气虚血瘀证患者血清对CRL-1730凋亡相关基因、miRNA表达的影响及补阳还五汤的干预作用

胡小勤， 蒙 丹， 吴燕春， 段慧明， 曾雪霞， 陶美霖， 苏日香， 曾学文*

(1.广西中医药大学药学院， 南宁 530022； 2.广西中药药效研究重点实验室， 南宁 530022)

高血压是致死和致残的首要因素之一，据统计，2030年全球由高血压导致的痴呆患者将达到 7 550 万[1]。研究表明，心血管疾病中50%以上是由高血压引起的,77%左右脑卒中患者有较长的高血压病史，高血压已成为影响人民健康生活的主要疾病[2]。高血压病是以体循环动脉压增高为主要临床表现的综合征，是临床最常见的心血管疾病[3]，气虚血瘀证又是高血压病的常见中医证型[4]。研究表明，高血压病的发病机制[5]及气虚血瘀证的形成机理[6]都与细胞凋亡的病理生理过程有密切的关系。细胞凋亡是通过激活和启动细胞内某些特定基因,调控细胞主动死亡过程, 维护内环境稳定[7]。而研究发现半胱氨酸蛋白酶(Caspases)在细胞凋亡、炎症和纤维化中起核心作用，Caspases的激活是细胞凋亡必经的途径，Caspase-3是反应的关键节点[8]，且人体抑癌基因53(p53)是一种调节许多基因表达的转录因子，可诱导细胞的凋亡和衰老[9]。

临床上广泛应用补阳还五汤治疗高血压病气虚血瘀证, 且研究证实了补阳还五汤可以纠正高血压病气虚血瘀证引起的细胞凋亡[10]，并通过抑制气虚血瘀型高血压脑出血恢复期患者神经凋亡,改善血液循环,提高疗效[11]。课题组前期研究发现：高血压病气虚血瘀证患者血清可以诱导血管内皮细胞凋亡[12]，并在蛋白质层次发现其机制可能与调节半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、p53、跨膜糖蛋白(Fas)、跨膜糖蛋白配体(FasL)、兔抗人单克隆抗体(Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)的表达量有关，并发现补阳还五汤对内皮细胞凋亡有一定的保护作用[13]。故在课题的前期研究基础上运用实时定量聚合酶链式反应(palymerase chain reaction,PCR)芯片技术和miRNA芯片技术，对凋亡细胞的相关基因和miRNA表达进行检测，从mRNA和miRNA层面探讨高血压病气虚血瘀证患者血清诱导内皮细胞凋亡的机理。以体外培养的人脐静脉血管内皮细胞作为观察对象，进一步探讨高血压气虚血瘀证的患病机制，对促进高血压病的防治和提高人民生活健康具有深远的意义。

1 材料

1.1 实验动物

60只SPF(specific pathogen free)级SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄各30只，体重180～210 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(桂)2014—0002。

1.2 细胞

人脐静脉内皮细胞株CRL-1730，由复旦生物医学研究院细胞资源中心提供。

1.3 试剂

胎牛血清、青霉素、链霉素购自Hyclone；高糖DMEM购自Gibco；0.25%胰酶-0.02%EDTA购自北京索莱宝；聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、牛血清白蛋白(BSA)购自BioFrox；一抗p53、Bax、Fas、Casapse-3、Fas-L、Bcl-2、微管蛋白(Tublin)均购自Sant Cruz；二抗Cy-3羊抗鼠；正常熔点琼脂糖(NMA)、低熔点琼脂糖(LMA)购自Takara；溴化乙锭(EB)购自Sigma；三(羟甲基)胺基甲烷(Tris)购自南京凯基；RIPA组织细胞快速裂解液购自Boster；乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)购自上海前尖生物科技有限公司。

1.4 仪器

低温台式离心机、CO2培养箱为美国Thermo公司生产；水平电泳槽、电泳仪为美国BIO-RAD公司生产；微量移液器为德国Eppendorf公司生产；实时定量PCR仪为美国Bio-Rad公司生产。

2 资料与方法

2.1 健康体检者及患者的选择

选择健康对照组20例，为广西中医药大学附属瑞康医院健康体检者。高血压病气虚血瘀证患者及高血压病非气虚血瘀证患者各40例，为2016年7月—2017年1月在广西中医药大学附属瑞康医院心血管内科就诊的高血压病患者。高血压病诊断标准采用1999年世界卫生组织/国际高血压学会制定的诊断标准，气虚血瘀证辨证标准采用1986年全国中西医结合虚证及老年病防治学术会议制订的《中医虚证辨证参考标准》及2011年中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制定的《血瘀证中西医结合诊疗共识》。高血压病气虚血瘀证血压水平与高血压病非气虚血瘀证患者的血压水平比较，两者无统计学差异，P>0.05，具有可比性；高血压病气虚血瘀证、高血压病非气虚血瘀证及健康对照组三组性别和年龄比较，无统计学差异，P>0.05，具有可比性。

2.2 健康人及患者血清收集

空腹状态下，每人约取8 mL外周血，放入带帽无菌不抗凝试管，自凝后4 ℃、3 000 r/m、15 min离心，取上清液置于无菌EP(eppendorf)管，混合均匀，灭活，过滤除菌，置于-80 ℃环境，备用。每组血清混合后用于细胞学实验。

2.3 含药血清及空白对照血清制备

按补阳还五汤原方剂量进行水煎提取(生黄芪120 g、当归尾6 g、赤芍5 g、地龙3 g、川芎3 g、红花3 g、桃仁3 g)。按照体表面积换算用药量，高、中、低剂量组大鼠分别用等效剂量的2、1、1/2倍，即24、12、6 g/(kg·d)灌胃(ig)。将SD大鼠随机分为空白对照组和补阳还五汤高、中、低剂量组，空白对照组共30只，补阳还五汤高、中、低剂量组各10只。各剂量组每天以补阳还五汤 ig 2次，两次间隔12 h，连续ig 3 d。于末次ig 1 h后颈动脉放血，自凝后 4 ℃、3 000 r/m、15 min离心，取上清液，将同组血清混合，放入无菌EP管，混匀，灭活，过滤除菌，-80 ℃ 冻存备用。在同样条件下，以等体积的生理盐水ig，制备空白对照组血清。

2.4 分组

分6组按以下方法制备混合血清培养液：高血压病气虚血瘀证组、高血压病非气虚血瘀证组、健康对照组分别以10%高血压病气虚血瘀证患者血清、10%高血压病非气虚血瘀证患者血清、10%健康者血清混合10%空白血清及80%的高糖DMEM培养基，补阳还五汤高、中、低剂量组分别以10%补阳还五汤高中、低剂量含药血清混1血高血压病气虚血瘀证患者血清及80%高糖DMEM培养基。

2.5 细胞培养

取对数生长期内皮细胞，消化、传代后， 按1×105/mL密度, 接种于25 mL培养瓶, 4 mL/瓶，每组6瓶，共36瓶，每2瓶为一个样品。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养24 h后，换无血清培养液同步化以后，分为6组，继续培养24 h。

2.6 实时定量PCR芯片技术检测与人细胞凋亡相关的89个关键基因的表达

核糖核酸(RNA)抽提，脱氧核糖核酸酶I (DNase I) 消化RNA样品，RNA纯化，RNA质量检测，反转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)链，作为PCR模板；将模板加入到荧光定量PCR(RT2 Real-Time TM SYBR Green PCR Master Mix)反应体系中。取96孔板，在各孔中固定好基因特异性引物，然后加入等量的PCR反应体系，进行PCR反应。采用配套软件计算PCR芯片中的每个基因的循环阈值(Ct)。采用△△Ct方法比较对应的两个样本中同一基因的表达量变化。通过分析看家基因Ct值的一致性，确定合适的标准化方法。

2.7 miRNA芯片技术检测与人细胞凋亡相关的384个miRNAs表达

方法同2.6。

2.8 miRNA靶基因预测

应用数据库Targetscan，查询miRNA的靶基因，网址: http://www.targetscan.org/vert_71/。

2.9 筛选目的差异靶基因

对miRNA靶基因预测结果及差异表达的基因作交集分析，即为目的差异的靶基因。

3 结果

3.1 实时定量PCR芯片技术检测结果

实时定量PCR芯片技术检测结果如图1所示。

高血压病气虚血瘀证组与高血压病非气虚血瘀证组比较，共检测到2个差异基因，均表达上调。上调基因包括CIDEA和FASLG。但是无统计学差异，如表1所示。

表1 高血压病气虚血瘀证组与高血压病非气虚血瘀证组 mRNA差异表达(n=3)

高血压病气虚血瘀证组与健康对照组比较，共检测到27个差异表达基因，其中，有25个上调基因和2个下调基因，有统计学差异的上调基因22个，下调基因1个(P<0.05)，上调基因包括BCL10、BCL2A1、BCL2L1、BIK、BNIP2、BRAF、CASP10、CASP3、CASP4、CASP5、CFLAR、GADD45A、HRK、MCL1、RIPK2、TNFRSF10B、TNFRSF11B、TNFRSF9、TNFSF8、TP53、TP53BP2、XIAP，下调基因为TNFSF10，如表2所示。

表2 高血压病气虚血瘀证组与健康对照组mRNA 差异表达(n=3)

每组3个样本，A～F依次为高血压病气虚血瘀证组、高血压 病非气虚血瘀证组、健康组、补阳还五汤高剂量组、补阳还 五汤中剂量组、补阳还五汤低剂量组图1 DNA变性琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 DNA denaturation agarose gel electrophoresis

高血压病非气虚血瘀证组与健康对照组比较，共检测到24个差异表达基因，其中，有21个上调基因和3个下调基因，有统计学差异的上调基因19个和下调基因1个 (P<0.05)。上调基因包括BCL10、BCL2A1、BCL2L1、BIK、BNIP2、CASP3、CASP4、CASP5、CFLAR、GADD45A、HRK、MCL1、RIPK2、TNFRSF10B、TNFRSF9、TNFSF8、TP53、TP53BP2、XIAP，下调基因为TNFSF10，如表3所示。

表3 高血压病非气虚血瘀证组与健康对照组mRNA 差异表达(n=3)

补阳还五汤高剂量组与高血压病气虚血瘀证组比较，共检测到9个差异表达基因，其中，有6个上调基因和3个下调基因，有统计学差异的上调基因5个和下调基因1个 (P<0.05)，上调基因包括BCL2、DAPK1、GADD45A、NFKB1、TRADD，下调基因为CASP10，如表4所示。

表4 补阳还五汤高剂量组与高血压病气虚血瘀证组 mRNA 差异表达(n=3)Table 4 Differential mRNA expression between the high-dose group of Buyanghuanwu Decoction and the hypertension group with qi deficiency and blood stasis syndrome (n=3)

补阳还五汤中剂量组与高血压病气虚血瘀证组比较，共检测到13个差异表达基因，其中，有8个上调基因和5个下调基因，有统计学差异的上调基因7个，下调基因3个 (P<0.05)，上调基因包括BCL2、BCL2A1、BIRC3、DAPK1、GADD45A、NFKB1、TRADD，下调基因包括CASP10、CASP5、TNFRSF9，如表5所示。

表5 补阳还五汤中剂量组与高血压病气虚血瘀证组 mRNA 差异表达(n=3)

补阳还五汤低剂量组与高血压病气虚血瘀证组比较，共检测到11个差异表达基因，其中，有5个上调基因和6个下调基因，有统计学差异的上调基因5个，下调基因3个 (P<0.05)，上调基因包括BCL2、DAPK1、GADD45A、NFKB1、TRADD，下调基因为CASP1、CASP10、TNFRSF9，如表6所示。

表6 补阳还五汤低剂量组与高血压病气虚血瘀证组 mRNA差异表达(n=3)

3.2 miRNA芯片技术检测结果

miRNA芯片技术检测结果如图2所示。高血压病气虚血瘀证组与高血压病非气虚血瘀证组比较，共检测到38个差异表达基因，其中，有14个上调基因和24个基因下调，有统计学差异的上调基因1个和下调基因3个 (P<0.05)，上调基因包括hsa-miR-299-5p，下调基因分别为hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-153-3p。结果如表7所示。

每组3个样本，A～F依次为高血压病气虚血瘀证组、高血压病 非气虚血瘀证组、健康组、补阳还五汤高剂量组、补阳还五 汤中剂量组、补阳还五汤低剂量组图2 DNA变性琼脂糖凝胶电泳图(1∶1)Fig.2 DNA denaturation agarose gel electrophoresis (1∶1)

表7 高血压病气虚血瘀证组与高血压病非气虚血瘀证组 miRNA差异表达(n=3)

高血压病气虚血瘀证组与健康对照组比较，共检测到29个差异表达基因，其中，有17个上调基因和12个下调基因，有统计学差异的上调基因8个和下调基因2个 (P<0.05)，上调基因包括hsa-miR-181a-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-30b-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-449a、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-212-3p，下调基因为hsa-miR-127-3p、hsa-miR-874-3p。结果如表8所示。

表8 高血压病气虚血瘀证组与健康对照组miRNA 差异表达(n=3)

高血压病非气虚血瘀证组与健康对照组比较，共检测到45个差异表达基因，其中，有31个上调基因和14个下调基因，有统计学差异的上调基因12个和下调基因2个 (P<0.05)，上调基因包括hsa-miR-374b-3p、hsa-miR-181a-3p、hsa-miR-376b-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-30b-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-449a、hsa-miR-375、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-212-3p，下调基因为hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-874-3p。结果如表9所示。

表9 高血压病非气虚血瘀证组与健康对照组miRNA 差异表达(n=3)

补阳还五汤高剂量组与高血压病气虚血瘀证组比较，共检测到64个差异表达基因，其中，有60个上调基因和4个下调基因，有统计学差异的上调基因6个(P<0.05)，下调基因无统计学差异。上调基因包括hsa-miR-499a-5p、hsa-miR-570-3p、hsa-miR-887-3p、hsa-miR-548c-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-135a-5p。结果如表10所示。

表10 补阳还五汤高剂量组与高血压病气虚血瘀证组 miRNA差异表达(n=3)

补阳还五汤中剂量组与高血压病气虚血瘀证组比较，共检测到21个差异表达基因，其中，有5个上调基因和16个下调基因，上调基因无统计学差异，有统计学差异的下调基因3个 (P<0.05)，分别为hsa-miR-129-5p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-411-5p。结果如表11所示。

表11 补阳还五汤中剂量组与高血压病气虚血瘀证组 miRNA差异表达(n=3)

补阳还五汤低剂量组与高血压病气虚血瘀证组比较，共检测到41个差异表达基因，其中，有33个上调基因和8个下调基因，有统计学差异的上调基因3个和下调基因1个 (P<0.05)，上调基因包括hsa-miR-187-3p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-139-5p，下调基因为hsa-miR-410-3p。结果如表12所示。

表12 补阳还五汤低剂量组与高血压病气虚血瘀证组 miRNA差异表达(n=3)

3.3 miRNA靶基因预测结果及差异靶基因确定

3.3.1 高血压病气虚血瘀证组与健康组比较

有22个显著上调的mRNA，1个显著下调的mRNA；8个显著上调的miRNA，2个显著下调的miRNA。对8个上调miRNA做靶基因预测，发现这8个上调的miRNA可以靶向3 041个mRNA；下调的mRNA(1个)与上调的miRNA(8个)的靶基因(3 041个)取交集，得到1个既有显著变化的 mRNA，也是上调miRNA的靶基因，即TNFSF10。

3.3.2 高血压病非气虚血瘀证组与健康组比较

有19个显著上调的mRNA，1个显著下调的mRNA；13个显著上调的miRNA，2个显著下调的miRNA；对13个miRNA做靶基因预测，发现这13个上调的miRNA可以靶向3 680个mRNA；下调的mRNA(1个)与上调的miRNA(13个)的靶基因(3 680个)取交集，得到1个既有显著变化的mRNA，也是上调miRNA的靶基因，也是TNFSF10。

3.3.3 其余各组之间比较

差异mRNA和miRNA靶基因没有交集。

4 讨论

细胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的细胞主动死亡过程[14]。实时定量PCR芯片(RT-qPCR array)借助基因芯片的高通量检测技术与功能和qPCR 的精确定量，能同时对上百个基因的mRNA表达进行定量分析，是一种可靠的、高度灵敏的分析方法[15]。micro RNAs(miRNAs)是一种21～25 nt的单链小分子RNA，是非编码RNA的重要组成部分，miRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性[16]。近年来，越来越多的研究表明，miRNA能够靶向调控凋亡因子的激活剂或抑制剂，进而影响凋亡因子的表达，也可以直接靶向凋亡调控因子，影响细胞凋亡的进程[17-19]。

实验结果发现：高血压气虚血瘀证组与健康组相比，在89个mRNA中，有22个上调基因和1个下调基因，具有统计学差异(P<0.05)，在384个mi RNA中有8个上调miRNA和2个下调miRNA，显示有统计学意义(P<0.05)；高血压非气虚血瘀证组在89个相关基因中有19个上调基因和1个下调基因，具有统计学差异(P<0.05)，在384个miRNA中有12个上调miRNA和2个下调miRNA，具有统计学差异(P<0.05)。另外，补阳还五汤高剂量组在89个相关基因中有5个上调基因和1个下调基因，具有统计学差异(P<0.05)，在384个miRNA中只有6个上调miRNA，具有统计学差异(P<0.05)；补阳还五汤中剂量组在89个相关基因中有7个上调基因和3个下调基因，具有统计学差异(P<0.05)；在384个miRNA中只有3个下调miRNA，具有统计学差异(P<0.05)；与高血压病气虚血瘀证组相比，补阳还五汤低剂量组在89个相关基因中有5个上调基因和3个下调基因，具有统计学差异，在384个miRNA中有3个上调miRNA和1个下调miRNA，具有统计学差异(P<0.05)。

本实验结果说明：高血压病气虚血瘀证患者血清诱导内皮细胞凋亡的机制，与相关基因和mi RNA的上调和下调有关，补阳还五汤各剂量组能纠正高血压病气虚血瘀证的相关基因和miRNA表达的失衡，具有抑制高血压病气虚血瘀证细胞凋亡的作用。将miRNA靶基因预测结果与差异mRNA做交集分析，发现与高血压病气虚血瘀证和高血压病非气虚血瘀证的形成密切相关的核心因子都是TNFSF10 基因。肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor,TNF) 是Carswell 等于1975 年发现的一种能使肿瘤细胞凋亡、坏死的细胞因子[20]。TNFSF10(TRAIL)是在其序列同源性的基础上，由Wiley等[21]于 1995年首次发现，是肿瘤坏死因子配体家族的成员之一，TNFSF10对体外的细胞系包括一些肿瘤细胞系具有诱导凋亡的作用。与其他 TNF 家族成员相比，TNFSF10具有两个特性：①TNFSF10在大多数组织中都能表达，而其他TNF 家族成员只在活化的细胞中暂时表达[22]；②TNFSF10是一个促凋亡配体，目前发现在一些炎症细胞和肿瘤细胞中能够高表达。但是，关于TNFSF10促进内皮细胞凋亡的研究，尚未见报道。下一步，拟进行扩大样本的实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法(western blot)验证，每组取20个样本，对TNFSF10基因和蛋白质表达进行检测。TNFSF10得到验证后，可以作为高血压病的一种分子标志物，在临床诊断方面尤其是高血压病的预警方面发挥作用，此外，也可以作为降压药物的疗效评价的指标。