1BL/1RS 易位小麦面筋蛋白的分离重组及其面条品质研究

李 婷，李 双，周小玲，王发祥，俞 健，刘永乐，李向红✉

（1. 长沙理工大学 化学与食品工程学院，湖南 长沙 410114；2. 克明面业股份有限公司，湖南 长沙 410116）

小麦是我国的三大主粮之一，也是全球重要的谷物品种，年产量已超1 亿t[1]。小麦经磨制加工后即为面粉，小麦的营养成分包括淀粉、脂质、蛋白质等，主要营养在小麦胚中，是小麦蛋白质的主要来源[2]。小麦蛋白分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中，清蛋白和球蛋白为小麦提供营养成分，醇溶蛋白和谷蛋白两者构成面筋蛋白，为面条提供网络结构。小麦面筋蛋白的质量和含量对面条的品质具有很大的影响，当小麦中含有较高含量的面筋蛋白时，面条的硬度会显著增加，韧性也会显著增大，并且当面筋蛋白含量一定时，谷蛋白与醇溶蛋白的比值不同，面团的品质也会有所不同[3]。

面粉制品种类丰富，广受人民的喜爱，挂面就是典型的面制品之一，挂面在我国的市场广阔，与此同时，其可提升空间也十分巨大。小麦的质量品质、磨粉设备和制作工艺的限制都使得直接生产出来的小麦粉成品通常难以满足某些食品生产的具体要求，食品工业中通常使用物理的、化学的或生物的方法来有目的地改善小麦粉的品质[4]。近年来，国内对面条品质的影响的研究主要是从面粉的组成成分如淀粉、蛋白质等开展[5]，也有研究集中在醇溶蛋白易位和不同分子量谷蛋白对面条品质的影响，基因和蛋白质组学有助于揭示食品或加工产品的深层质量变化机制[6-7]。分离重组法常用于研究面粉的各项成分对面条品质的影响，是在尽可能保证面条中原成分的性质不变的条件下，用合适的方法将面粉中的组分分离出来，然后再通过改变其中成分的比例或者对其中的成分进行修饰，重新组合，以确定这些成分对面条质量的影响，能够避开统计分析法和扫描电镜（SEM）观察法的弊端，尽可能准确的反应真实的情况[8]。

因此，本研究将以克明面业提供的两种优质面条小麦粉（SJ 和HMT）为研究对象，利用分离重组技术制备面条，通过对面条的蒸煮特性及质构特性进行测定，明晰小麦面粉中醇溶蛋白与谷蛋白的比例及不同分子量的麦谷蛋白对面条品质的影响，为小麦种植、面条专用粉生产和面条的品质提高提供坚实的理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

淀粉、小麦粉（SJ、HMT）、标样小麦：湖南省长沙市克明面业股份有限公司。

1.2 仪器与设备

LYZY-2 沉降值测定仪：广州沪瑞明仪器有限公司；LGJ-10 真空冷冻干燥机：河南兄弟仪器设备有限公司；DYCZ-25D 电泳仪：北京六一生物科技有限公司；T10 basic 手持式均质机：德国IKA公司；等电聚焦仪：美国GE 公司；ScanMaker i800扫描仪：上海中晶科技有限公司；RE-2000B 旋转蒸发仪：天津予华仪器科技有限公司；TA.XT.Plus食品物性测定仪：英国Stable Micro System 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小麦粉基本成分测定

分别参照 GB 5009.4—2016、GB 5009.5—2016、GB 5009.3—2010、GB/T 14685—1995 测定小麦粉灰分含量、蛋白质含量、水分含量及沉降值。

湿面筋含量与面筋指数测定：将洗净的面筋放入面筋指数测定仪小筛板中，将筛板装至仪器中，进行离心，离心完毕，取出筛板，称量筛上物与筛下物质量。湿面筋含量即为筛上物与筛下物的总重。面筋指数计算方法见公式：

1.3.2 小麦粉高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析

麦谷蛋白提取及样品制备：称取小麦粉约2 g，使用NaCl 溶液去除球蛋白并重复两次，再使用醇溶液除去醇溶蛋白，重复两次。将醇提所得沉淀用20 mL 2%十二烷基硫酸钠提取液在室温下提取2 h。经过离心（4 000 r/min，20 min），得到上清液保留准备进行SDS-PAGE 分析。

SDS-PAGE 方法如下：将上述20 μL 上清液蛋白样品与等体积的样品缓冲液混合，水浴后离心备用。先恒流（20 mA）条件下电泳1 h 左右，待样品进入分离胶换成恒压（50 mA）条件电泳3 h 左右。电泳完毕后，置于染色盘中，加入50 mL固定液固定1 h，倒掉固定液，再染色2 h，染色结束加入脱色液脱色，并不断更换脱色液直至脱色完全，使用凝胶成像扫描仪扫描凝胶。

1.3.3 醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）分析

醇溶蛋白提取及样品制备：称取小麦粉约0.03 g，加入0.4 mL 提取液（0.05 g 甲基绿，25 mL 2-氯乙醇，1 mL β-巯基乙醇定容至100 mL），在4 ℃下静止24 h 后，8 000 r/min 离心10 min 后，取上清液进行A-PAGE 分析。

A-PAGE 方法如下：用20 mL 凝胶溶液（25 g丙烯酰胺，1 g N-N-亚甲基双丙烯酰胺，15 g 尿素，0.25 g 抗坏血酸，0.006 5 g 硫酸亚铁，5 mL冰醋酸，0.25 g 甘氨酸定容至250 mL）对样品进行电泳。加入70 μL 0.6%过氧化氢后，迅速加入电极缓冲液（40 mL 冰醋酸和0.4 g 甘氨酸定容至1 000 mL），电泳时恒定电压为500 V，电泳时间为甲基绿指示剂移动至凝胶底部所需时间的三倍。电泳结束后，用10%三氯乙酸固定凝胶，染色结束加入脱色液脱色，使用7%醋酸对凝胶进行保存，使用凝胶成像扫描仪扫描凝胶。

1.3.4 原小麦面条质构特性测定

将原小麦粉于面粉搅拌器中，搅拌完毕，将面团用压延辊进行多次压延，压延完成后将面皮卷在木轴上继续醒发20 min 后用面条切割轮制作面条；制得的面条放入烤箱烘烤，烘干后取出置于密封袋内保存。取适量原小麦面条按照其最佳蒸煮时间煮制后在冷水中静置2 min 后捞出，用滤纸吸干其表面大部分水分，使用TA-XT Plus 物性分析仪测定其质构特性。

1.3.5 醇溶蛋白和谷蛋白的分离提取

取适量面粉按照料液比2∶1 加入水，充分揉混成表面光滑的面团。揉混完成后向容器中加入适量水，静置20 min。再将面团反复在水下搓洗，直至溶液澄清时，得到面筋。将洗得的面筋按照料液比1∶10 加入70%的乙醇，先用均质机将样品处理为均匀的浆状，再在35 ℃下搅拌3 h，搅拌完成后，3 500 r/min 下离心30 min，得到上清液和沉淀部分。沉淀即为谷蛋白；上清液通过旋转蒸发，沉淀即为麦醇溶蛋白。两次沉淀均经真空冷冻干燥后即得所需蛋白成品。

1.3.6 重组面条的制作

按照原面粉∶混合粉（淀粉、麦醇溶蛋白和麦谷蛋白）=1∶1 进行重组粉的配制，其中保持重组粉内的蛋白质总含量不变，改变蛋白质含量中谷蛋白与醇溶蛋白的比值，同时所有的成分都按照14%的湿基进行校正。取1 kg 重组粉于面粉搅拌器中，搅拌完毕，将面团用压延辊进行多次压延，压延完成后将面皮卷在木轴上继续醒发20 min 后用面条切割轮制作面条；制得的面条放入烤箱烘烤，烘干后取出置于密封袋内保存。

1.3.7 重组面条蒸煮特性测定

干物质吸水率的测定：取20 根重组面条，称重，烧杯需烘干至恒重。将称重后的面条放入装有500 mL 沸水的烧杯中煮至最佳蒸煮时间捞出，置于100 mL 冷水中冷却2 min，冷却后捞出在滤纸上沥水5 min 之后再次称重，面条增加的质量与干面条的质量的比值即为面条的干物质吸水率。

干物质损失率的测定：将上述步骤中煮制及浸泡面条的水混合后继续在电炉上加热煮沸，将大部分水分蒸发掉后把烧杯放入烘箱（105 ℃）内烘干至恒重，烧杯增加的质量与干面条质量的比值即为面条的干物质损失率。

1.3.8 重组面条质构特性测定同1.3.4 对重组面条质构特性进行测定。

1.3.9 重组面条感官评定

取60 根长度为22 cm 的面条，煮至最佳蒸煮时间后捞出，置于冷水中浸泡2 min，分放至事先准备好的小碗中待品尝。参照SB/T 10137-93 对面条进行评定。

表1 面条品尝项目和评分标准Table 1 Noodle tasting items and scoring criteria

1.4 数据分析

使用软件Excel 2010 对实验数据进行分类整理及绘图，采用SPSS 软件进行显著性和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 两种小麦粉基本性质比较

两种小麦粉的基本成分含量如表2 所示，蛋白质含量和面筋指数大致相同，但沉淀值含量有显著性差异。麦谷蛋白主要以聚合体的形式存在，通过分子间二硫键作用形成线状结构[9]，赋予面团弹性。根据SDS-PAGE 图谱上迁移速率，可将麦谷蛋白进一步分为分子量介于10～70 kD 之间的低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）和分子量介于80～140 kD 之间的HMW-GS[10-11]。HMW-GS 仅占成熟种子蛋白质总量的10%左右，但它决定了小麦加工品质的35%～40%[12]。从两种小麦品种中提取的谷蛋白SDS-PAGE图谱如图1 所示，两种小麦粉的高分子量麦谷蛋白亚基分别为SJ（1, 7+8, 5+10），HMT (1, 7+8, 5+10)，两者无显著差异，只有低分子量麦谷蛋白组成有较明显的差异。HMW-GSs（1, 13+16, 14+15, 5+10）对面团加工质量有积极的影响，亚基（1, 5+10）对提高面条品质具有重要作用[13-14]。如图2 所示，根据A-PAGE图谱的相对迁移率，小麦醇溶蛋白被分为α、β、γ和ω 四个部分，两种小麦品种均出现1BL/1RS 易位特征性条带。1BL/1RS 易位系1RS 上引入黑麦碱基因，在1BL 上缺少低分子量谷蛋白和部分醇溶蛋白，从而影响面条品质。He 等研究发现小麦品种1BL/1RS 易位会导致面条的弹性及粘性下降，对面条的弹性、粘性等有显著的负面影响[15]，原小麦面条的质构评价见表3。

表2 原小麦粉基本成分指标Table 2 Basic composition indicators of different varieties of wheat flour

表3 原小麦面条的质构评价Table 3 Textural evaluation of high-quality wheat noodles

图1 SDS-PAGE 图谱Fig. 1 SDS-PAGE patterns

图2 A-PAGE 图谱Fig.2 A-PAGE patterns

2.2 重组面条的蒸煮特性

面条的蒸煮特性常被作为面条品质判定的项目之一，淀粉颗粒和面筋蛋白结构之间的相互作用规律也能够间接地被反映出来[16]。当重组面条内的蛋白质含量不变时，醇溶蛋白的含量增加能够使得重组面条的吸水率显著增大，见图3；而两种重组面条的干物质损失率都没有太大变化，见图4。根据相关性结果显示，重组面条重组面条的吸水率与谷蛋白和醇溶蛋白的比值呈显著负相关，而与干物质损失率无显著相关性，见表4。干物质的损失率是由淀粉从蛋白质网络结构中脱离出来而流失造成的，因此，蛋白质含量高的面粉中的面筋网络结构更加紧密，能够减少淀粉分子的流失，从而减少面条的干物质损失率[17]，本次实验中重组面条中的淀粉和蛋白质含量都是一定的，只对谷蛋白和醇溶蛋白的比值进行了调整，故重组面条的干物质损失率没有明显变化。

表4 相关性分析Table 4 Correlation analysis

图3 重组面条吸水率Fig.3 Reconstituted noodles water absorption

2.3 重组面条的质构特性

当醇溶蛋白的含量增加时，重组面条的硬度显著减小，粘度显著增大；当谷蛋白的含量增加时，重组面条的坚实度和剪切做功都显著增大，且拉伸力和拉伸距离也显著增大，见表5、表6。当重组面条中的蛋白质含量一定时，重组面条的粘度和麦谷蛋白与麦醇溶蛋白的比值呈显著线性负相关；而重组面条的拉伸力、拉伸距离、硬度、坚实度和剪切做功和麦谷蛋白与麦醇溶蛋白的比值呈显著正线性相关，见表7。面条的坚实度和剪切做功都能反映出面条的硬度和弹性，谷蛋白赋予面条硬度和弹性，这是由于麦谷蛋白的亚基之间能够形成疏水作用、氢键和分子间二硫键，这能够使麦谷蛋白聚合形成大分子聚合物，这种大分子聚合物形成的网络结构具有较强的硬度和弹性，也是赋予面条硬度和弹性的主要原因[18]。面条硬度和面条抗拉伸强度由谷蛋白决定，醇溶蛋白赋予面条粘度，因为麦醇溶蛋白内含有较高的非极性氨基酸含量，所以其水合时具有极高的粘度，较小的抗伸长性，面条的延展性和粘性与麦醇溶蛋白密切相关[19]。但是在本次实验中发现，较高的谷蛋白含量也能够使面条的延展性显著增强，当面条中含有较高的麦谷蛋白含量时，能够形成大量的网络结构，这种具有弹性的网状结构同样能赋予面条良好的延展性，故重组面条的拉伸力和拉伸距离都随谷蛋白含量的相对含量增加而增大。

表5 重组面条的质构评价（SJ）Table 5 Textural evaluation of reconstituted noodles (SJ)

表6 重组面条的质构评价（HMT）Table 6 Textural evaluation of reconstituted noodles (HMT)

表7 相关性分析Table 7 Correlation analysis

2.4 重组面条的感官评定

根据感官评定结果可以看出，十个样品的评分都相对较低，都在70 分左右，表示重组面条的品质还有待进一步提升，见表8、表9。其原因可能是混合粉中只有淀粉、麦醇溶蛋白和麦谷蛋白三种成分，即使再与原面粉1∶1 混合，仍缺少了原面粉中的脂质等成分，并且制得的蛋白的活性也可能受到了一定的影响，达不到原面粉的效果。

表8 重组面条感官评定结果（SJ）Table 8 Sensory evaluation results of reconstituted noodles (SJ)

表9 重组面条感官评定结果（HMT）Table 9 Sensory evaluation results of reconstituted noodles (HMT)

3 结论

本研究明确了两种优质小麦粉的基本成分、高分子量谷蛋白亚基及醇溶蛋白1BL/1RS 易位情况，通过分离重组方法制作了不同麦谷蛋白和麦醇溶蛋白比例的重组面条，对重组面条的蒸煮特性和质构特性进行测定后发现：当重组面条中的蛋白质含量一定时，重组面条的吸水率、粘度与麦谷蛋白与麦醇溶蛋白的比值呈显著线性负相关（P＜0.05）；而重组面条的拉伸力、拉伸距离、硬度、坚实度和剪切做功和麦谷蛋白与麦醇溶蛋白的比值呈显著正线性相关（P＜0.05）。本文能够为小麦种植、面条专用粉生产和面条品质提高提供理论依据，但小麦粉品种产地较为单一，关于基因和蛋白质组学对面条品质的研究亦有待更为深入的研究。