20例ABO血型抗原表达异常样本的血型基因分析

孙文杰，何婷，韩军，任晓艳，李萌

南京医科大学附属儿童医院输血科，江苏 南京210008

ABO血型系统最初由Karl Landsteiner于1990年提出［1］，至今仍然是输血医学和器官移植医学中最重要的血型系统，输注ABO不相容血液可能导致急性血管内溶血、肾衰竭甚至死亡。同样，移植ABO不相容器官可能导致急性体液性排斥反应［2］。因此，正确的血型鉴定是保障临床输血安全的重要保障。而在血清学方法进行ABO血型鉴定时，往往表现出正反定型不一致、抗原抗体反应性减弱或出现混合凝集视野等现象，ABO血型定型困难，疑为亚型。目前国内对于ABO亚型的研究报道多为个别案例［3,4］，而且多为ABO血型1-7外显子的基因分析［5,6］。本研究对20例血清学检测异常的血型样本同时进行了ABO基因1-7外显子编码区及其上游调控区域基因扩增及测序，探讨其ABO血型抗原表达减弱的分子生物学机制。

1 资料和方法

1.1 研究对象

12例样本来自南京市儿童医院外科择期手术住院患儿；8例样本来自患儿家属。其中例1和例2（例1之母）、例4例5（例3之母）和例6（例4外婆）、例7和例8（例7之母）、例9和例10（例9之父）、例11和例12（例11之父）、例14和例15（例14之母）、例19和例20（例19之父）间存在家系关系。本研究已通过南京医科大学附属儿童医院医学伦理委员会审查，批件号：202101006-1。

1.2 材料

1.2.1 血清学检测 ABO-RhD血型鉴定卡、低离子抗人球蛋白卡（伯乐公司）、抗体筛选红细胞、抗A抗B血型定型试剂、抗D、抗H（上海血液生物医药有限公司）、专用离心机（伯乐公司，ID-Centrifuge 12 S Ⅱ）、专用孵育箱（伯乐公司，ID-Incubator 37 S Ⅰ）。

1.2.2 分子生物学检测 DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）、2xGC Buffer、rTaq、dNTP Mixture（takara）、PCR扩增仪（GeneAmp9700PCR系统，ABI）、高速离心机（SIGMA1-14台式小型离心机）、涡旋混匀器（VDRTEX-5）、电泳仪（JY300C、北京君意东方电泳设备有限公司）、凝胶电泳槽（JY-SP3、北京君意东方电泳设备有限公司）、紫外分析仪（JYO2S、北京君意东方电泳设备有限公司）、水浴箱（天津泰斯特三用恒温/电热恒温水箱SHHW21.420AⅡ）。

1.3 方法

1.3.1 血清学检测 采用微柱凝集法及盐水试管法对18例样本进行ABO血型血清学鉴定。严格执行操作说明书。

1.3.2 分子生物学检测

1.3.2.1 DNA提取 取全血200 μL，按照试剂盒操作说明提取DNA。

1.3.2.2 PCR扩增及测序 委托天津吉诺泰普生物科技有限公司设计并合成针对ABO基因第1-7外显子及上游调控区域特异性引物，PCR扩增并直接测序，确定基因型。每个反应总体积50 μL：Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，2×GC Buffer I 25 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各1 μL，DNA 模板5 μL、ddH2O 13.6 μL。反应过程为：96℃3 min，1 cycle；96 ℃25 s/68 ℃60 s 5 cycles；96 ℃25 s/65 ℃50 s/72 ℃45 s，10 cycles；96 ℃25 s/62 ℃50 s/72 ℃45 s，25 cycles；72 ℃3 min，1 cycle。PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶鉴定后测序，与NCBI 在线比对数据库nucleotide blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）确定其基因型。

2 结果

2.1 血清学检测结果

对20 例样本使用微柱凝集法及盐水试管法进行ABO血型鉴定，血清学检测结果显示，ABO血型抗原表达异常，正反定型结果不符合。其中A抗原表达异常3例，B抗原表达异常17例；10例样本红细胞与抗B试剂反应出现混合视野；样本红细胞与抗H试剂反应均有不同程度增强；20例样本均疑为ABO亚型（表1）。

2.2 分子生物学检测结果

ABO 血型基因第1-7 外显子及其上游调控区域PCR产物直接测序结果，根据ISBT 网站提供的Names for ABO(ISBT 001)blood group alleles v1.1 171023综合结果判定（以ABO*A1.01为参考序列）。结果显示，20例样本中，1例为A2B型，1例为A2型，2例为AB3型，3例为B3型，4例为Bw12型，4例B抗原表达减弱的样本发生启动子区域变异；1例A抗原表达减弱样本发生第7外显子1054delC；另外4例样本ABO血型1-7外显子及其调控区域未发现变异（表2，图1）。

表2 20例样本ABO血型PCR直接测序结果Tab.2 Results of direct PCR sequencing of ABO blood group in the 20 cases

3 讨论

ABO基因位于第9号染色体q34.2，由7个外显子组成，共编码354个氨基酸。如果在ABO等位基因编码区发生突变，则可引起ABO基因编码物质的改变，从而导致ABO血型亚型生成［7］。目前研究ABO亚型主要有血清学水平（免疫血液学实验）、基因水平（DNA、mRNA）、蛋白水平（氨基酸、糖基转移酶、蛋白构象）3种模式［8］。国外在蛋白质或氨基酸水平有相关研究［9］。然而因为ABO基因77%编码序列位于第6和第7外显子，这两个编码区是决定ABO基因产物糖基转移酶功能的主要部分［10］，因此关于外显子区域，尤其第6、7外显子测序研究的文献报道较多［11-13］，针对启动子区域研究较少。本次研究，对20例血清学检测ABO血型抗原表达减弱的样本1-7外显子编码区及其上游调控区域同时进行测序分析，以进一步揭示ABO血型亚型的分子生物学机制。

研究显示，上游调控区碱基变异导致的B抗原减弱样本4例；未见既往报道的碱基变异2例（1例为上游调控区-119位C>T变异，1例为第7外显子1054位点del C）；另有4例样本血清学结果明显异常而其上游调控区及1-7外显子基因检测均未见异常，疑为内含子区域变异造成ABO血型抗原异常表达。20例样本中，例1及例2存在家系关系，确定其基因型分别为ABO*A2.01/ABO*B.01、ABO*A2.01/ABO*O01.01；例4、例5 及例6存在家系关系，确定其基因型分别为B3.04/A1.02、B3.04/O.01.01、B3.04/O.01.02；例7 及例8 存在家系关系，确定其基因型分别为B3.02/A1.02、B3.02/O.01.02；例9及例10存在家系关系，确定其基因型分别为Bw.12/O.01.01、Bw.12/O.01.01；例11及例12存在家系关系，确定其基因型分别为Bw.12/O.01.01、Bw.12/O.01.01；有4例样本发生启动子区域变异，其中例13、例14及例15发生ABO基因启动子区域-35_-18位点碱基缺失（例14及例15存在家系关系），导致B抗原表达减弱；例16发生启动子区域-119位C>T的异常变异，因对以往正常ABO血型基因分析并未发现此变异，故推测该变异导致了B抗原表达减弱；例3样本发生第7外显子1054位点缺失碱基C，因对以往正常ABO血型基因分析并未发现此变异，故推测该变异导致A抗原表达减弱；例17、例18、例19及例20样本红细胞与抗B试剂血清学反应均呈现混合视野现象，其中例19及例20为父子关系，且二者ABO血型血清学鉴定格局一致，但经ABO血型1-7外显子及其调控区域基因检测，该4例样本均未发现变异。

启动子在转录过程中起调控作用，通过活化RNA聚合酶，使之与DNA模板准确结合并具有转录起始的特异性。同时，ABO基因内含子1的变异可能也影响ABO血型基因的表达。国内关于这方面研究较少。国外文献报道［14］，在红细胞生成过程中，miR-331-3p 和miR-1908-5p 的表达水平与血型抗原水平呈负相关。Sano等［15-17］研究发现，ABO基因内含子1中有基因表达的调控元件，位于ATG翻译起始位点3’方向、+5653和+6154核苷酸位点之间，可以增强ABO基因启动子的活性，而删除包含此调控序列的内含子1，会导致Bm亚型表型。Fenne等［18］研究发现，内含子1中GATA碱基突变，会引起ABO血型血清学试验正反定型不符。有文献报道［19-21］，ABO基因内含子1中红细胞特异性调控元件（+5.8 kb）负责抗原差异表达，RUNX1基序单点突变可下调+5.8 kb位点的转录活性，导致A或B抗原表达减少。ABO基因内含子1中核昔酸的突变也可使红细胞表面A抗原表达减弱，导致AmB表型出现。

本次研究的20例样本中，7例变异发生在第6外显子；5例发生于第7外显子，其中1054位点del C未见报道，疑为新的变异位点；4例样本碱基变异位于启动子区域，其中-119位C>T未见报道，疑为新的变异位点；4例样本未发现其上游调控区域及外显子1-7明显变异，推测其是否与mRNA合成异常有关，是否由于RUNX1位点突变下调ABO基因内含子1的+5.8 kb位点的转录活性，从而导致B抗原减弱。目前国内对内含子1碱基变异导致ABO血型抗原表达异常的的研究较少，值得进一步关注。

另有资料认为A亚型比B亚型更常见［22］，但是本次实验20例亚型中仅有2例A抗原表达异常，B亚型明显较A亚型更常见。分析其原因可能与中国人群血型分布不同于欧美有关，不同地域不同民族人群中血型分布，也是输血医学发展需要关注的方向之一。