姬松茸种质资源的遗传多样性研究*

万 诚，李蕾嘉，熊 雪，罗文敏，王 莹

（贵州省生物研究所，贵州 贵阳 550009）

姬松茸（Agricus blazei Murrill）属于蘑菇亚纲（Agricomycetidae） 蘑菇目（Agaricales） 蘑菇科（A－garicaceae） 蘑菇属（Agaricus），又名巴西蘑菇、小松菇、太阳菇、巴西蘑菇、柏拉氏蘑菇[1]。原产于巴西，由于姬松茸具有浓郁的杏仁香味，菌盖嫩，菌柄脆，美味可口，含有丰富的蛋白质、维生素、糖类物质和多种氨基酸，在巴西圣保罗地区被称为“上帝的蘑菇”[1]。自1992年福建省农业科学院从日本成功引种以来，国内学者对姬松茸进行了大量研究，尤其是近几年，姬松茸的生物活性研究发展迅猛，并有一定成效[2]。尤其发现了其多糖具有抗疲劳、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗炎、保肝等作用[3]。然而，姬松茸的育种工作仍存在杂交育种周期长、种质资源有限、缺乏定向育种关键技术等难题[4]，姬松茸DNA指纹图谱的研究也基本停留在2012年的研究水平[5-8]。因此，研究利用RAPD、ISSR、酯酶同工酶技术对11个不同来源的姬松茸菌株进行遗传多样性研究，分析比较其亲缘关系，为姬松茸的优良品种选育以及进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

共收集姬松茸菌株11个，名称与来源见表1。

表1 供试菌株及来源情况Tab.1 Strains and sources

1.1.2 培养基

用于姬松茸菌丝培养的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA） 综合培养基配方（1 L）：马铃薯200 g、蛋白胨 5 g、蔗糖 20 g、琼脂 20 g，水 1 000 mL，120℃灭菌 30 min。

1.1.3 主要试剂

用于酯酶同工酶试验的药品有：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、固蓝RR盐均购自上海生工生物工程股份有限公司。

用于RAPD与ISSR试验的药品有：琼脂糖、核酸染料、Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、2×SanTaq PCR Mix、DNA分子量标准，均购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.4 引物合成

试验所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成与提供，扩增引物见表2。

表2 RAPD与ISSR引物序列Tab.2 RAPD and ISSR primer sequences

1.1.5 主要仪器

高速冷冻离心机，购自四川蜀科仪器有限公司；PCR扩增仪器，购自赛默飞世尔科技公司；水平电泳槽、垂直电泳槽、电泳仪均，购自北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统，购自广州博鹭腾生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌丝体培养

将保存的11个姬松茸菌种接种于PDA培养基，每个菌种接种20个平板，用封口膜包好，24℃避光培养。

1.2.2 菌丝拮抗试验

以培养皿圆心为中心，在同一平板上按“品”字形接种，每个培养皿接入3种菌株，3次重复，24℃避光培养，观察不同菌株间是否产生拮抗反应。

1.2.3 DNA提取

取PDA培养基中的姬松茸菌丝0.1 g，采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取。

1.2.4 RAPD与ISSR法反应体系及电泳

RAPD法PCR扩增体系选用25 μL体系[9]：2×SanTaq PCR Mix 12 μL、无 菌 水 10 μL、引 物 2 μL、DNA 1 μL。PCR 程序为 94℃预变性 5 min；94℃变性1 min，以低于引物溶解温度（Tm值）5℃复性 1 min，72℃延伸 2 min，共 35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。

ISSR法PCR扩增体系选用20 μL体系[10]：2×SanTaq PCR Mix 10 μL、无菌水 7 μL、引物 2 μL、DNA 1 μL。PCR 程序为 94℃预变性 4 min；94℃变性30 s，以低于引物溶解温度（Tm值） 5℃复性45 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。

采用1.5%浓度琼脂糖凝胶检测已扩增好的片段，用凝胶成像仪观察并拍照。

1.2.5 酯酶同工酶方法及电泳

在NY/T 1097-2006食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法[11-12]的基础上进行改良优化。取PDA培养基中的姬松茸菌丝0.2 g，加入1 000 μL样品提取液（0.4 mol·L-1的Na2HPO4与NaH2PO4）冰浴研磨，在4℃下10 000 r·min-1离心10 min后取上清液备用；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳后再进行染色处理。

1.2.6 RAPD与ISSR法数据统计与分析

各泳道在同一位置扩增出的强带或可分辨性较好的弱带记为“1”，未扩增出条带记为“0”，用NTsys软件进行聚类分析，采用非加权组平均法（UPGMA） 构建系统树[13]。

1.2.7 酯酶同工酶法数据统计与分析

观察样品酶带，计算酶带的迁移率Rf，同时观察凝胶片，绘制凝胶酶谱，根据酶谱进行读带分析，强带记为“1、1、1”，次强带记为“0、1、1”，弱带记为“0、0、1”，无带记为“0、0、0”，用NTsys软件进行聚类分析，采用非加权组平均法（UPGMA） 构建系统树[14]。

2 结果与分析

2.1 供试姬松茸菌株的拮抗分析结果

不同姬松茸菌株拮抗反应统计及其形态特征见表3及图1。

表3 供试姬松茸菌株间的拮抗反应Tab.3 Antagonistic effect between Agaricus blazei strains

图1 部分姬松茸菌株间的拮抗效果Fig.1 Antagonistic effect of some Agaricus blazei strains

由图1可知，各菌株菌丝生长隔离型、沟型、隆起型均有表现，11个供试姬松茸菌株间均存在拮抗反应，表明11个菌株之间的亲缘关系较疏远，后续将利用RAPD、ISSR、酯酶同工酶技术进一步鉴定。

2.2 供试姬松茸菌株的RAPD分析结果

从20条RAPD引物中筛选出的10条扩增条带较多的引物及其扩增结果见表4，引物RAPD-08对11个供试姬松茸菌株的扩增结果见图2。

表4 供试姬松茸菌株的RAPD多态性分析Tab.4 RAPD polymorphism analysis of Agaricus blazei strains

图2 引物RAPD-08对11个供试姬松茸菌株的扩增结果Fig.2 Amplification results of primer RAPD-08 on 11 tested Agaricus blazei strains

由表4可知，以11个供试姬松茸菌株的基因组DNA为模板，用筛选出的10条RAPD引物进行PCR扩增，共扩增出110条DNA片段，其中多态性条带数为88条，多态性比例为76.9%。由图2可知，扩增的DNA片段长度为200 bp～3 000 bp，其遗传多样性分析聚类分析结果见图3。

图3 11个供试姬松茸菌株的RAPD聚类分析结果Fig.3 RAPD cluster analysis of 11 tested Agaricus blazei strains

由图3可知，相似系数在0.65时，11个供试姬松茸菌株被分为三大群类，第一大类包括姬松茸51119与姬松茸51242；第二大类在相似系数0.72时又分为2个亚类，第一亚类由姬松茸51148、姬松茸51237、姬松茸-4、姬松茸SWS-JS05、姬松茸SWS-JS07和姬松茸SWS-JS08组成，第2亚类为姬松茸52195和姬松茸SWS-JS06；第三大类仅有姬松茸51392。

2.3 供试姬松茸菌株的ISSR分析结果

从20条ISSR引物中筛选出的12条扩增条带较多的引物及其扩增结果见表5，引物ISSR-02对11个供试姬松茸菌株的扩增结果见图4。

表5 供试姬松茸菌株的ISSR多态性分析Tab.5 ISSR polymorphism analysis of Agaricus blazei strains

由表5可知，以11个供试姬松茸菌株的基因组DNA为模板，用筛选出的12条ISSR引物进行PCR扩增，共扩增出122条DNA片段，其中多态性条带为87条，多态性比例为70%，由图4可知，扩增的DNA片段长度为200 bp～3 000 bp，其遗传多样性分析聚类分析结果见图5。

图4 引物ISSR-02对11个供试姬松茸菌株的扩增结果Fig.4 Amplification results of primer ISSR-02 on 11 tested Agaricus blazei strains

图5 11个供试姬松茸菌株的ISSR聚类分析结果Fig.5 ISSR cluster analysis of 11 tested Agaricus blazei strains

由图5可知，相似系数在0.79时，11个供试姬松茸菌株被分为三大群类，第一大类包括姬松茸51119与姬松茸51242；第二大类在相似系数0.82时又分为2个亚类，第一亚类由姬松茸51148、姬松茸51237、姬松茸-4、姬松茸SWS-JS07、姬松茸SWS-JS05、姬松茸SWS-JS06和姬松茸SWS-JS08组成，第2亚类仅有姬松茸52195；第三大类仅有姬松茸51392。

2.4 供试姬松茸菌株的酯酶同工酶分析结果

根据酯酶同工酶电泳结果绘制成的酯酶条带谱见图6。

由图6可知，在11个供试姬松茸菌株中共检测到83条酶带，其中最少的为6条，最多的为9条，酯酶条带表现出显著的强弱性，迁移率Rf介于0.27～1.00，说明供试菌株具有丰富的遗传多样性，其遗传多样性分析聚类分析结果见图7。

图6 11个供试姬松茸菌株的酯酶同工酶电泳图谱Fig.6 Esterase isozyme patterns of 11 tested Agaricus blazei strains

图7 11个供试姬松茸菌株的酯酶同工酶聚类分析结果Fig.7 Cluster analysis of esterase isozymes of 11 tested Agaricus blazei strains

由图7可知，在相似系数在0.76时，11个供试姬松茸菌株被分为三大群类，第一大类包括姬松茸51119、姬松茸51237与姬松茸51242；第二大类在相似系数0.79时又分为2个亚类，第一亚类由姬松茸51148、姬松茸SWS-JS05和姬松茸52195组成，第2亚类由姬松茸-4、姬松茸SWS-JS07、姬松茸SWS-JS06和姬松茸SWS-JS08组成；第三大类仅有姬松茸51392。

2.5 11个供试姬松茸菌株的聚类分析结果

基于3种方法的遗传多样性聚类分析（图3、图5、图7） 中，RAPD法各菌株的相似系数介于0.476 7～0.918 6，ISSR法各菌株的相似系数介于0.631 6～0.907 9，酯酶同工酶法各菌株的相似系数介于0.629 6～0.925 9。RAPD、ISSR、酯酶同工酶法菌株之间相似系数分别在0.65、0.79、0.76时，均把11个供试姬松茸菌株划分为三大类群，RAPD与ISSR法将姬松茸51119和姬松茸51242为一类，姬松茸51392为一类，其余菌株为一类；酯酶同工法略有不同，将姬松茸51119、姬松茸51242和姬松茸51237归为一类，其余与RAPD与ISSR结果相同。在11个供试姬松茸菌株中，姬松茸-4与姬松茸51237亲缘关系最远，相似系数为0.476 7；姬松茸-4与姬松茸SWS-JS07亲缘关系最近，相似系数为0.925 9。

综合10个RAPD引物、12个ISSR引物和酯酶同工酶对11个供试姬松茸菌株的多态性分析结果，共计获得189条多态性条带用于构建UPMGA聚类树状图见图8。

图8 11个供试姬松茸菌株的RAPD、ISSR和酯酶同工酶聚类分析结果Fig.8 RAPD,ISSR and EST cluster analysis results of 11 tested Agaricus blazei strains

由图8可知，聚类分析后各菌株间相似系数在0.619 0～0.899 5，在相似系数为0.75时，11个供试姬松茸菌株被划分为三大类群，第一大类包括姬松茸51119和姬松茸51242；第二大类在相似系数0.79时又分为2个亚类，第一亚类由姬松茸51148、姬松茸51237、姬松茸-4、姬松茸SWS-JS07、姬松茸SWS-JS08和姬松茸SWS-JS05组成，第2亚类由姬松茸52195和姬松茸SWS-JS06组成；第三大类仅有姬松茸51392。

3 讨论与结论

由于每种分子标记技术都能根据扩增区域的不同反映样品的遗传多样性，其中RAPD法是以单一的寡核苷酸序列为引物进行PCR非定点扩增，操作方法简单，但RAPD稳定性较差，易产生非特异性条带[15]；ISSR法是在1个～4个碱基组成的串联重复序列外，还在引物的5’端或3’端加上2个～4个非重复的锚定简并碱基，操作方法简单，退火温度较高，具有较好的稳定性、重复性和多态性[16-17]。因此，对样品进行遗传作图、基因定位、遗传多样性、系统发育树等研究时，应尽可能选用多种标记法，以避免单一类分子标记存在的片面性[18]。

本研究分别采用10条RAPD引物、12条ISSR引物和酯酶同工酶对不同溯源的11份姬松茸菌株进行遗传距离以及遗传多样性的分析。RAPD、ISSR两种分子标记的多态性比例分别为76.9%与70.0%，反映出11个供试姬松茸菌株在种间、种内存在较高的遗传多样性。3种方式的聚类均能将不同来源的供试姬松茸菌株区分开，并区分为三大类。为了避免单一类标记法的偶然与片面性，研究又基于RAPD、ISSR和酯酶同工酶3种标记的结果分析，构建供试姬松茸菌株UPMGA聚类分析图。将11个供试姬松茸划分为三大类，姬松茸51119和姬松茸51242为一类，姬松茸51392为一类，其余菌株为一类。试验为姬松茸杂交选育亲本奠定了理论基础，为姬松茸菌株优良农艺性状的良种选育提供了参考和依据，有利于姬松茸种质资源的评价。

王守现等[19]研究同时利用酯酶同工酶、RAPD与ISSR法对6个不同灰树花（Polyporus frondosus） 菌株进行遗传多样性分析，将6个灰树花菌株划分为三大类，也同时验证了RAPD和ISRR分析结果与酯酶同工酶分析的结果一致。从研究结果看，在样品数较少的情况下，单独采用RAPD、ISSR和酯酶同工酶法3种方式的聚类分析均能将样品区分开，并且所划分的类群相差极小，采用综合分析法也与单一标记法的结果几乎一致，但也存在着一定的偶然性与片面性。或许在样品数量逐渐增加至足够多时，分类的结果也会存在差异，则需要更多的标记方法以及更多的引物种类综合聚类分析才能更加全面。