广州市九里香白粉病病原鉴定
2021-10-14宋晓兵凌金锋彭埃天崔一平陈霞
宋晓兵 凌金锋 彭埃天 崔一平 陈霞
(广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室广东广州510640)
九里香［Murraya paniculata（L.）Jack］，别名千里香，为芸香科九里香属植物，分布于广东、海南、广西、福建等地，我国华南地区广泛栽培，常被作为园林风景树、绿化植物、盆景等［1］。九里香病虫害较少发生，得益于九里香叶或根中的香豆素、黄酮、植物精油、萜类化合物具有较好的抗病原菌和昆虫拒食活性［2］。研究发现，九里香作为芸香科属的植物也受柑橘木虱传播的黄龙病菌侵染，但并不产生明显的症状，也称之为柑橘黄龙病菌的隐症寄主［3］，是柑橘黄龙病抗性育种研究的潜在资源；九里香对柑橘木虱的吸引效果显著优于砂糖橘、贡柑、椪柑等柑橘类果树［4-6］，也是目前人工饲养柑橘木虱的天然优势寄主。
2020年4 月，笔者在广东省农业科学院植物保护研究所大丰试验基地发现九里香白粉病暴发，为探明九里香白粉病的暴发成因，结合形态学和分子生物学对九里香白粉病的病原菌进行鉴定，以期为九里香白粉病的综合防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品
病害标本采自广东省农业科学院植物保护研究所大丰试验基地。
1.1.2 试剂
AxyPrep基因组DNA小量试剂盒购自Axygen Scientific Inc.；2×EasyTaq® PCR SuperMix（-dye）PCR扩增试剂盒购自TransGen Biotech Co.，Ltd.；引物合成及PCR产物测序服务均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 病害症状及病原菌形态观察
田间观察九里香白粉病的发病症状，包括病斑的形状、大小、色泽及病害对九里香植物的危害情况［7］。用灭菌针挑取新鲜病叶表面的白色粉层少许，做成临时玻片，用光学显微镜观察病原菌的形态特征。
1.2.2 病原菌分子鉴定
用灭菌金属匙刮取九里香叶面的白色粉状物，液氮研磨，采用DNA试剂盒法提取病原菌DNA。分别选取扩增真菌ITS和LSU rDNA D1/D2区域的PCR通用引物，ITS（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）［8］和LSU rDNA（NL1：5′-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3'，NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）［9］，以提取的病原菌DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）：模板1.0 μL，2×EasyTaq®PCR SuperMix 12.5 μL，上 下游引物 各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩 增 程 序：95℃预 变 性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，35个 循 环；72℃延 伸10 min。用1.2%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，检测后直接送公司测序。采用DNA Star软件对病原菌的ITS和LSU rDNA序列进行分析，并分别在NCBI数据库进行BLAST比对，利用MEGA 6.0进行序列的同源性分析，邻接法构建系统发育进化树，确定病原菌的分类地位。
2 结果与分析
2.1 九里香白粉病症状
田间症状观察九里香白粉病发现，白粉病主要危害九里香的叶片、叶柄和嫩枝，病菌集中发生在叶片正面。叶片发病，初期先形成近圆形的白霉斑，有辐射状银白色的菌丝，然后逐步蔓延至整个叶片，病斑上出现一层白粉，呈现大小不一的白粉病斑；嫩枝发病，枝条发育停滞，嫩叶扭曲畸形、出现不均匀黄斑，随着病情的加重，整个嫩枝的叶片逐步萎黄、皱缩、卷曲甚至凋谢，最后叶片脱落、枝条枯死；花序发病，表面着生一层白粉，影响结实，果实易脱落。病害多发生于九里香嫩叶、嫩芽、嫩枝及花序，严重者也可为害老叶（图1）。
图1 九里香白粉病田间症状
2.2 病原菌形态特征
取适量白粉菌粉制成玻片在光学显微镜下观察，可看到大量的分生孢子，分生孢子多数椭圆形，中间膨大、两端圆、单胞、无色。分生孢子长30.32～40.25 μm，宽13.56～21.33 μm；圆柱形足细胞长27.65～46.53 μm（图2）。
图2 九里香白粉病病原菌形态特征
2.3 病原菌分子鉴定
为了进一步验证引起九里香白粉病病原菌所属的分类地位，选用ITS和LSU rDNA D1/D2区两个检测引物对提取的九里香白粉病病原菌基因组进行检测，经过PCR和测序后分别获得644 bp的ITS片段和617 bp的LSU rDNA片段，将测序所得序列进行BLAST在线比对，并分别构建系统发育进化树。
BLAST搜索比对显示，九里香白粉病病原菌的ITS序列与GenBank中已登录的Erysiphe quer‐cicola多 个 序 列（MH137255.1、LC128427.1、MH333267.1）的同源性均达到99.84%，九里香白粉病病原菌的LSU rDNA D1/D2区序列与GenBank中已登录的Erysiphe quercicola多个序列（MN165985.1、MH561927.1、LC306873.1）的同源性均为100%。病原菌ITS片段的聚类结果（图3）表明，九里香白粉病病原菌（Erysiphestrain JLX2020）的ITS序 列 与Erysiphe quercicola多个序列归为一类，而柑橘炭疽病菌（Colletot‐richum gloeosporioides）的两个菌株（AJ311884.1、JN390897.1）则归为另一个聚类。病原菌LSU rDNA片段的聚类结果（图4）表明，九里香白粉病病原菌（Erysiphestrain JLX2020）的LSU rDNA序列与Erysiphe quercicola多个序列归为一类，而柑橘炭疽病菌的两个菌株（CQ495616.1、KM278589.1）则归为另一个聚类。
图3 基于ITS序列构建的九里香白粉病菌系统发育进化树
图4 基于LSU rDNA D1/D2区序列构建的九里香白粉病菌系统发育进化树
基于病原菌的无性态形态特征与分子生物学的同源性分析，可以将九里香白粉病的病原菌鉴定为子囊菌门（Ascomycota），锤舌菌纲（Leo‐tiomycetes），白粉菌目（Erysiphales），白粉菌科（Erysiphaceae），白粉菌属（Erysiphe）的E.quercicola。
3 讨论
白粉菌具有专性寄生的生物学特性，因而寄主植物相对固定，但存在病原菌的宿主转移［10-11］。前人报道广西九里香白粉病由白粉菌（Oidiumsp.）引起［12］，近来一些研究认为，应该将Oidium重新分类至Erysiphe、Golovinomyces或Podos‐phaera［13］。研究发现，海南地区的橡胶树、马占相思、九里香和红木白粉病病原菌的ITS序列之间相似性均在99%以上，与（Erysiphe quercicola）的ITS序列也具有99%以上的同源性［14］。本研究中的广州市九里香白粉病证实由Erysiphe querci‐cola引起，与前人报道相一致。
最新的白粉菌分类系统中，白粉菌科主要分为5个族，包含16个有性型属和2个无性型属［15］。根据报道，中国的22个省、5个自治区和2个直辖市均有白粉病发生，共计13个有性型属328种及44变种［16］。白粉菌形态鉴定过程中，由于一些种类间在形态上存在过渡类型，使得一些种的界定比较困难。本研究采用真菌ITS和LSU rDNA双鉴别基因对引起九里香白粉病的病原菌进行鉴定，增加对病原菌所属种类划分的准确性；通过病原菌形态学和分子生物学鉴定，确定引起广州市九里香白粉病的病原菌为Erysiphe quercicola。气温反复、阴雨天气是诱发九里香白粉病的重要因素，需要及时采用杀菌剂代森锰锌、三唑酮及时预防或治疗。
